地皮菜挥发油的化学成分及抗氧化性研究
赵秀玲, 刘永杰
黄山学院 生命与环境科学学院,安徽 黄山 245021

作者简介:赵秀玲(1973-),女,新疆人,硕士,讲师,主要从事食品功能性研究.E-mail:zhaoxiuling2008ren@aliyun.com.

摘要

分别采用水蒸汽蒸馏法(SD)和超临界流体萃取(SFE)法萃取地皮菜挥发油,利用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对挥发油成分进行分离鉴定.经过GC-MS分析,共分离鉴定出80种挥发性化合物,其中烷烃28种、烯烃9种、酯类9种、酸类4种、酮类5种、萜类4种、醇类5种、醛类7种、杂环类1种、酚类1种、环氧类1种、胺类2种、醚类2种、酸酐类1种及炔类1种.2种提取物共有组分为8种.用水蒸汽蒸馏法和超临界流体萃取得到的挥发油成分有明显差异.地皮菜挥发油具有良好的体外抗氧化活性,SFE挥发油比SD挥发油对ABTS自由基、DPPH自由基、羟基自由基抑制作用有较强的效果.其最大挥发油体积分数的清除率均超过50%,挥发油样品体积分数与各项抗氧化活性指标呈量效关系,清除ABTS自由基、DPPH自由基、羟基自由基的ED50为:SD挥发油分别为9.954%,9.424%,11.394%(体积分数,下同),SFE挥发油分别为8.267%,6.012%,9.121%.

关键词: 地皮菜; 挥发油; 气相色谱-质谱(GC-MS); 抗氧化活性
中图分类号:TS255.1 文献标志码:A 文章编号:0258-7971(2017)03-0454-09
Chemical constituents antioxidant activities in vitro of volatile oil from Nostoc commune
ZHAO Xiu-ling, LIU Yong-jie
School of Life and Environment Sciences,Huangshan University,Huangshan 245021,China
Abstract

The volatile oil components in Nostoc Commune were extracted by steam distillation (SD) and supercritical fluid extraction (SFE) and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS).A lot of 80 volatile compounds were identified in Nostoc Commune,including 28 alkanes,9 vinyl compounds,9 esters,4 acids,5 ketones,4 terpenes,5 alcohols,7 aldehydes,1 heterocycle,1 phenol,1 epoxy,2 amines,2 etherses,1 anhydride class and 1 acetylene,with 8 compounds being detected in both.The great differences existed between the volatile constituents extracted by steam distillation and superitical fluid extraction methods.The volatile oils exhibited significant antioxidant activities in vitro in a concentration-dependent fashion.The volatile oils of SFE showed a stronger competence on ABTS·,DPPH·,the hydroxyl free radicals than the volatile oils of SD,and the maximum inhibition could be over 50%,its ED50 values of scavenging ABTS·,DPPH·and ·OH:9.954%,9.424%,11.394%( V/V) of the volatile oils of SD,8.267%,6.012%,9.121%( V/V) of the volatile oils of SFE.

Keyword: Nostoc Commune; volatile oil; gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); antioxidant activity

地皮菜(Nostoc Commune), 学名普通念珠藻, 别名地耳、地踏菇、地衣、地木耳及地软等, 为蓝藻科念珠藻属的片状藻类[1].地皮菜从南北极到赤道、从高山到沙漠、从森林到海滩均有分布, 为适应不同的生活环境, 在漫长的系统演化过程中, 地皮菜演变出千姿百态、色彩斑斓的形态, 如秕状地衣(leprose)、壳状地衣(crustaceous)、鳞状地衣(squamulose)、叶状地衣(foliose)及枝状地衣(fruticose)[2].研究表明, 地皮菜富含蛋白质、粗脂肪、粗纤维、矿物质、维生素、氨基酸、蓝藻素及多糖等各种营养成分[3, 4].同时地皮菜含有多样的化学成分, 主要有缩酚类、单取代苯环类、蒽醌类、二苯骈呋喃类、甾体类、三萜类以及多糖等[5], 主要成分为地衣多糖和地衣酸.《本草纲目》记载:地木耳气味甘、平、无毒, 明目益气, 补肾.《中国药典》记载:野生地木耳对补充维生素、蛋白质, 清热解毒, 凉血明目, 夜盲、皮疹赤热等有明显滋补食疗效果.目前, 对地皮菜中活性物质的研究较多的为地皮菜水溶性多糖以及地皮菜黄酮的提取、结构特征及生物活性研究, 地皮菜可以作为一种良好的天然抗氧化剂及抗肿瘤活性物质来源; 人们还发现地皮菜提取液对蛋白酶活性、人鼻咽癌细胞、直肠癌细胞的生长和真菌均有抵制作用[6], 以及地皮菜提取物具有抗氧化、保湿和紫外线防护效果, 具有护肤功效等[7].而对地皮菜挥发油的化学成分及其抗氧化作用的研究鲜有报道, 本实验采用水蒸汽蒸馏法和超临界流体萃取法提取地皮菜中挥发油, 气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析其化学成分, 并以ABTS自由基、DPPH自由基、羟自由基清除作用为指标综合评价地皮菜2种方法提取的挥发油的体外抗氧化活性, 旨在丰富对地皮菜挥发油含量、组成和保健功能的认识.

1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器

野生地皮菜购于黄山市阳湖菜市场(自来水洗净泥沙, 后用蒸馏水清洗, 沥干水分, 备用), 经黄山学院生命与环境科学学院潘健博士鉴定为藻类蓝藻纲念珠藻科(Nostocaceae)念珠藻属植物念珠藻(Nostoc Commune Vauch)的藻体.

试剂:1, 1-二苯基-2-苦肼基(DPPH), 上海士锋科技有限公司; 2, 2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)-二氨盐(ABTS), 上海华蓝化学科技有限公司; VC, 无水乙醚, FeSO4溶液, H2O2, 水杨酸, 过硫酸钾, 无水硫酸钠等均为国产分析纯.

仪器与设备:UV754N紫外可见光光度计, 上海成光仪器厂; Agilent HP7890-5975C气相色谱-质谱联用仪, 美国Agilent公司; 精油提取器, 北京亚欧德鹏科技有限公司; 旋转蒸发仪, 上海亚荣生化仪器厂.

1.2 方法

1.2.1 地皮菜挥发油的萃取

(1) 水蒸汽蒸馏法(SD)萃取地皮菜挥发油.准确称取90g地皮菜, 置于研钵中磨成糊状移入500mL圆底烧瓶中, 加入300mL蒸馏水, 按水蒸汽蒸馏法萃取6h, 收集无水乙醚层, 旋蒸去乙醚后用无水硫酸钠干燥, 得无色透明油状液体, 共提取10次, 萃取率为0.69%.一部分挥发油用丙酮稀释至体积分数为20%, 用于抗氧化活性测定; 一部分挥发油用无水乙醚稀释进行GC-MS测试.

(2) 超临界流体萃取法(SFE)萃取地皮菜中挥发油.准确称取10g地皮菜, 置于研钵中磨成糊状移入超临界CO2萃取仪中, 以无水乙醇为夹带剂, 萃取压力为100MPa, 萃取温度为30℃, 流速为8mL/min, 萃取时间为1h, 得到深墨绿色黏稠油状物, 萃取率为1.89%.

1.2.2 GC-MS分析条件 色谱条件:选用HP-5MS弹性石英毛细管柱(0.25μ m, 30m× Φ 0.25mm).载气为高纯氦气, 流量为30mL/min, 分流比30∶ 1; 进样口温度280℃; 进样量为1μ L; 升温程序:40℃保持3min, 然后4℃/min到160℃, 保持3min; 然后6℃/min到290℃, 保持10min.

质谱条件:电子轰击(EI)离子源, 电子能量70eV; 溶剂延迟3.00min; 扫描质量数范围(m/z)235~450.

1.2.3 地皮菜挥发油抗氧化活性测定

(1) ABTS自由基清除作用的测定[8].将2.45mmol/L过硫酸钾与等量的7mmol/L ABTS溶液混合后置于暗处12h.用甲醇将ABTS溶液稀释至其在734nm处吸光度为0.7± 0.02.将体积分数为20%的地皮菜挥发油10、30、50、70、90、110μ L样品加入2mL ABTS自由基溶液中, 6min后测其吸光度(Ai).测定2mL甲醇溶液与不同体积样品液的吸光度(Aj); 测定2mL ABTS自由基溶液与样品体积相同甲醇混合后的吸光度(A0).以0.1mg/mL的VC为阳性对照.

清除率=[ (A0-Ai+Aj)/A0]× 100%

(2) DPPH自由基清除作用的测定.参照耿红梅等[9]、毕淑峰等[10]的方法加以改进.取20~120μ L待测样品置于6只试管中, 样品体积少于120μ L, 以丙酮补至120μ L.分别加4mL 24mg/L的DPPH-乙醇(95%)溶液混合, 混匀, 放置于黑暗中30min后于518nm下测定吸光度值(Ai).取蒸馏水与DPPH自由基溶液等体积相混合于试管中测定其吸光度值(A0).将样品挥发油乙醇溶液与无水乙醇进行等体积混合于试管中, 混匀, 放置于黑暗处30min后于518nm下测定吸光度(Aj).以0.1mg/mL的VC为阳性对照.按下式计算清除率:

DPPH自由清除率= A0-Ai+AjA0× 100%.

(3) 羟自由基清除作用的测定[11].精密量取体积分数为20%的地皮菜挥发油丙酮溶液10、30、50、70、90、110μ L置于6支试管中, 不满110μ L的以丙酮补充至110μ L, 分别加入9mmol/L FeSO4, 9mmol/L水杨酸-乙醇溶液2mL, 最后加入12mmol/L H2O2 2mL启动反应, 于37℃反应30min.以去离子水调零, 在波长510nm处测定样品吸光度A1; 另外, 以去离子水代替双氧水重复上述操作, 测得挥发油试样本身的分光光度值A2.同样, 以水代替挥发油, 测定分光光度A0.以0.1mg/mL的VC为阳性对照.

羟自由基清除率= 1-A1-A2A0× 100%.

1.2.4 数据处理与分析 所有数据均采用Excel统计和绘图所得, 数据为3次“ 平均值± 标准差” .

2 结果与分析
2.1 地皮菜挥发油化学成分的GC-MS分析结果

通过SFE法与SD法提取地皮菜中的挥发油, 采用气相色谱-质谱联用仪分析地皮菜挥发油的化学成分, 总离子流图见图1图2, 所得化学成分结果见表1表2.

表1可知, 采用SFE和SD 2种方法提取地皮菜挥发油, 经GC-MS分析, 共鉴定出80种挥发性化合物.2种方法共同检测到的化合物有8种, 包括1-十八烯、1-十六烯、邻苯二甲酸二异丁酯、亚油酸甲酯、亚油酸乙酯、二十四烷、正二十七烷及角鲨烯.

从SFE法提取到的地皮菜挥发油中分离出49个峰, 其中鉴定出34种化合物, 占总组分相对质量分数的92.774%.由表1可知, 主要成分为烷烃类化合物(31.368%)和烯烃类化合物(31.332%), 其次是酯类化合物(15.824%)、环氧类化合物(5.191%)及酸类化合物(2.987%), 其中相对质量分数较高的有8-十七碳烯(17.402%)、7-己基十三烷(9.199%)、9-己基十七烷(8.335%)、1-十八烯(7.546%)、邻苯二甲酸单乙基己基酯(6.461%)、反-9-十八烯酸甲酯(5.419%)及β -环氧石竹烷(5.191%).从SD法提取到的地皮菜挥发油中分离出289个峰, 其中鉴定出55种化合物, 占总组分相对质量分数88.518%.由表1可知, 主要成分为烷烃类化合物(39.18%), 其次为酸类化合物(16.382%)、烯烃类化合物(11.395%)及酯类化合物(6.469%).其中相对质量分数较高的有十七烷(17.726%)、棕榈酸(11.138%)、1-十八烯(5.946%)、亚油酸(5.244%)、二十四烷(5.104%)、二十烷(5.040%)及1-十六烯(4.130%).SD法鉴定出的地皮菜挥发性化合物中烷烃、酸类及醇类明显多于SFE法, 但不含杂环及环氧等化合物.2种方法萃取地皮菜挥发油经GC-MS分析, 地皮菜挥发油化学成分及含量相差较大.

图1 地皮菜SFE挥发油的GC-MS总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of SFE volatile oils from Nostoc Commune

图2 地皮菜SD挥发油的GC-MS总离子流图Fig.2 Total ion chromatogram of SD volatile oils from Nostoc Commune

表1 地皮菜挥发油的GC-MS分析结果 Tab.1 Results on GC-MS analysis of volatile oils from Nostoc Commune
表2 SD法和SFE法萃取地皮菜挥发油成分种类和相对质量分数 Tab.2 Component types and relative content of the volatile oils from Nostoc Commune by SD and SFE
2.2 地皮菜挥发油的抗氧化活性

2.2.1 地皮菜挥发油对ABTS自由基的清除作用 ABTS法基于清除系统中产生的自由基阳离子ABTS+的能力, 测定待测样品抗氧化活性[12].地皮菜SFE挥发油、SD挥发油及Vc对ABTS+均表现出较强的清除作用, 清除能力与加入样品体积分数呈正相关.SFE挥发油体积分数(x)与清除率(y)的回归方程y=346.35x+21.367(R2=0.9246); SD挥发油体积分数(x)与清除率(y)的回归方程y=338.21x+16.332(R2=0.9051); Vc体积分数(x)与清除率(y)的回归方程y=419.99x+29.787(R2=0.9506).地皮菜SFE、SD挥发油对ABTS+自由基的清除能力均弱于Vc, 但SFE挥发油对ABTS+自由基的清除能力强于SD挥发油.SFE、SD挥发油和Vc的ED50值分别为8.267%, 9.954%和4.813%.对ABTS+自由基的清除能力顺序为: Vc> SFE挥发油> SD挥发油.

2.2.2 地皮菜挥发油对DPPH自由基的清除作用 DPPH的有效清除表明样品具有打断脂质过氧化链式反应和降低羟基自由基、烷氧自由基或过氧化自由基的浓度的作用[13].地皮菜SFE挥发油、SD挥发油以及Vc都具有较好的DPPH自由基清除活性; 清除能力与挥发油体积分数呈相关性, 随着加入样品体积分数的增加, 样品及Vc对DPPH自由基的清除能力也随之增加.SFE挥发油体积分数(x)与清除率(y)的回归方程y=215.7x+37.032(R2=0.9308); SD挥发油体积分数(x)与清除率(y)的回归方程y=162.2x+34.714(R2=0.8971); Vc体积分数(x)与清除率(y)的回归方程y=303.14x+44.421(R2=0.9413).SFE挥发油、SD挥发油以及Vc的ED50值分别为6.012%, 9.424%和1.840%.对DPPH自由基的清除能力顺序为:Vc> SFE挥发油> SD挥发油.

2.2.3 地皮菜挥发油对羟自由基的清除作用 羟自由基是一种氧化活性很强的氧化剂, 可直接损伤各种生物膜, 导致多种疾病的发生, 羟自由基清除率是抗氧化作用的重要指标[14].地皮菜SFE挥发油、SD挥发油以及Vc对羟基自由基的清除效果均与样品加入体积分数成正比关系.SD挥发油体积分数(x)与清除率(y)的回归方程y=512.57x-8.404(R2=0.9606); SFE挥发油体积分数(x)与清除率(y)的回归方程y=404.21x+13.131(R2=0.9816); Vc体积分数(x)与清除率(y)的回归方程y=367.18x+33.868(R2=0.9697).SFE挥发油、SD挥发油以及Vc清除羟基自由基的ED50分别为9.121%, 11.394%, 4.393%.可见羟自由基的清除能力顺序为: Vc> SFE挥发油> SD挥发油.

3 讨论

马飞等[15]等采用顶空固相微萃取气相色谱质谱联用法(HS-SPME-GC/MS)对无氮和含氮条件下培养的地皮菜挥发物进行萃取和测定.本试验以SD和SFE法萃取的地皮菜挥发油的化学成分也是以烷烃(分别占39.18%和31.368%)为主, 但含量均低于文献[15]的报道.SD法挥发油醇类含量则也高于文献[15]的报道, 但SFE法挥发油不含醇类.SD、SFE法挥发油酯类和烯烃含量高于文献[15]的含量.酮类的含量与文献[15]的含量相当.SD法挥发油中含量最高的化合物十七烷(17.726%)与文献[15]中含量高的化合物相同(十七碳烷, 58.68%), 但含量有差异.SFE法挥发油中主要化合物与文献相差较大.2种方法萃取的挥发油共有组分仅为8种, 原因可能是SD法萃取物部分发生氧化或者分解, SFE法对于有些化合物来说萃取率低.所以在实际生产过程中采用多种方法联合提取有效成分.与文献相比, 本实验2种方法萃取的地皮菜挥发油的成分更具有层次性和丰富性.本文运用了2种不同的萃取方法对地皮菜的挥发性成分进行了对比分析, 具有一定的互补性, 且主要成分的化学组成与含量相差较大, 即使相同组分间其含量也有一定差异.可见, 由于地皮菜及萃取方法不同会导致挥发油化学成分有所不同.

大量研究表明植物萃取物具有很强的抗氧化活性, 有望成为人工合成抗氧化剂的潜在替代品.本实验发现, 地皮菜挥发油对OH、ABTS、DPPH自由基的清除能力较强, 并且SFE挥发油对OH、ABTS、DPPH自由基的清除能力强于SD挥发油.推测原因可能是SD挥发油提取时间长, 而且在高温下加热, 成分破坏严重, 影响了其活性作用.挥发油中含量较高的十七烷、二十烷及十八烷等开链脂肪烃, 酯类, 有机酸, 烯烃类和角鲨烯等成分, 具有很强的还原性, 其清除自由基活性强[16, 17].地皮菜挥发油的抗氧化性可能与有机酸、烯类、萜烯类化合物以及成分间的相互作用相关, 仍然未知的是哪种或哪几种成分发挥主要作用, 今后可对其活性成分进行进一步的分离及纯化研究.

4 结论

采用SFE和SD两种方法提取地皮菜挥发油, 经GC-MS分析, 共鉴定出80种挥发性化合物, 其中烷烃28种、烯烃9种、酯类9种、酸类4种、酮类5种、萜类4种、醇类5种、醛类7种、杂环类1种、酚类1种、环氧类1种、胺类2种、醚类2种、酸酐类1种及炔类1种, 2种方法得到的产物经检测共有化合物有8种.本研究通过对所提取挥发油的抗氧化活性分析的结果表明:地皮菜SFE挥发油和SD挥发油均具有较强的还原力, 对ABTS自由基、DPPH自由基和羟自由基均具有较高的清除效果, 其ED50值分别为:SD挥发油分别为59.67、56.63、90.86μ L, SFE挥发油分别为47.33、32.45、68.39μ L.在功能食品与药品方面具有较好的开发潜力.

The authors have declared that no competing interests exist.

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