RAD-seq技术在鱼类基因组学中的研究进展
刘涛, 李蓉, 肖蘅, 陈善元
云南大学 生命科学学院,云南 昆明 650091
通信作者:肖 蘅(1958-),男,四川人,教授,博士,主要从事动物遗传与进化研究.E-mail:xiaoheng@ynu.edu.cn.陈善元(1978-),男,云南人,教授,博士,主要从事动物遗传学与基因组学研究.E-mail:chensy@ynu.edu.cn.

作者简介:刘 涛(1992-),男,云南人,硕士生,主要从事鱼类分子遗传与进化研究.E-mail:745018389@qq.com;李 蓉(1990-),女,云南人,博士生,主要从事动物遗传学研究.E-mail:12014000884@mail.ynu.edu.cn.刘涛和李蓉对本文具有同等贡献.

摘要

限制性酶切位点相关DNA测序(restriction-site associated DNA sequencing,RAD-seq)是在二代测序技术上发展起来的简化基因组测序技术,该技术操作简单、实验成本低、并且简化了基因组的复杂度.鱼类是脊椎动物中物种数最多的类群,由于生活环境的不同,造就了丰富的物种多样性,常作为基因组学的研究对象.目前,在鱼类基因组学研究中,RAD-seq技术广泛应用于鱼类的系统发育、物种分化、遗传图谱、群体遗传和适应性进化等方面的研究.研究主要基于RAD-seq技术在鱼类基因组学中的研究进展进行综述,以期为鱼类资源的保护和合理利用提供参考依据.

关键词: 简化基因组测序; RAD-seq; 鱼类
中图分类号:Q953.36 文献标志码:A 文章编号:0258-7971(2018)06-1283-07
Research progress of RAD-seq in fish genomics
LIU Tao, LI Rong, XIAO Heng, CHEN Shan-yuan
School of Life Sciences,Yunnan University,Kunming 650091,China
Abstract

Restriction-site associated DNA sequencing (RAD-seq) is a reduced-representation sequencing technology developed from next generation sequencing technology.The technology is simple to operate,experimental low cost and greatly simplify the genomic complexity.Fish is the group with the largest number of species in vertebrates and has rich species diversity due to different living conditions,which is often used as research subjects in genomic studies.At present,RAD-seq technology has been widely used in phylogenetic relationships,species differentiation,genetic map,population genetics and adaptive evolution for fish genomics research.The research progress of RAD-seq in fish genomics is summarized in this paper and reference evidence is thus provided for conservation and rational use of fish resources.

Keyword: reduced-representation sequencing technology; RAD-seq; fish

简化基因组测序(reduced-representation sequencing)是在二代测序技术上发展起来的使用酶切技术、序列捕获技术或其他技术手段来降低物种基因组复杂度、对特定区域进行测序, 从而获得部分基因组序列信息的技术[1].简化基因组测序技术主要包括基于酶切的测序技术和低覆盖度的基因分型技术[2].基于酶切的测序技术又包括简化代表库(RRLs)测序技术[3]、简化多态序列复杂度(CRoPS)测序技术[4]、限制性酶切位点相关DNA测序(RAD-seq)技术[5]; 而低覆盖度的基因分型技术包括基于测序的基因分型(GBS)技术[6]和多元鸟枪法基因分型(MSG)技术[7].以上描述的5种测序技术中, RAD-seq技术应用最为广泛[8].

RAD-seq技术是近年来发展迅速、应用广泛的一种简化基因组测序技术[8], 具有技术流程简单、可获得大量分子标记、不受有无参考基因组的限制、数据利用率高和实验周期短等特点[2, 9, 10].为了降低RAD-seq技术操作的繁琐性和实验成本而研发出的技术有双酶切RAD测序(ddRAD-seq)技术[11]、Ⅱ B型限制性内切酶RAD测序(2bRAD-seq)技术[12]和同裂酶RAD测序(ezRAD-seq)技术[13].

鱼类是脊椎动物亚门中物种数量最多的类群[14].由于鱼类生活环境的复杂性, 造就了鱼类的生物多样性, 为适应性进化等研究提供了良好的材料.同时, 由于人为因素和自然因素的影响, 物种消失速度逐渐加快, 特别是稀有鱼类.因此, 对于鱼类遗传资源的保护和合理利用显得十分重要[15].

过去在鱼类基因组学的研究中, 由于使用线粒体DNA和核DNA片段的研究结果不一致, 导致了对某些鱼类的遗传与进化等方面的研究存在争议[16].近年来随着高通量测序技术的发展, 研究鱼类基因组学的方法也随之发展.目前在鱼类基因组学研究中, RAD-seq技术在系统发育、种群结构、遗传图谱和适应性进化的研究中得到了广泛应用.本文将对RAD-seq技术在鱼类基因组学中的研究进展作简要介绍, 以期为鱼类资源的保护和合理利用提供参考依据.

1 RAD-seq技术
1.1 RAD-seq技术的原理

RAD-seq结合酶切技术和分子标签技术以降低物种的基因组复杂度, 对特定区域进行测序, 从而获得部分基因组序列结构的技术.RAD-seq技术的原理[5]如图1所示:限制性内切酶对基因组DNA进行酶切, 产生大量的黏性末端(图1A); 在酶切后的基因组黏性末端两端连接上P1接头(图1B); 通过超声发生器将连接序列进行打断, 通过琼脂糖凝胶电泳筛选出符合大小的目的片段(图1C); 再打断后的DNA片段连接上P2接头(图1D); 对混池DNA进行PCR扩增反应(图1E).

图1 RAD-seq技术的原理示意图Fig.1 Principle of RAD-seq methods

RAD-seq技术能获得大量的分子标记, 且拼接后可获得较长的片段, 还可用于需要高密度标记的微卫星分子标记开发与引物设计[17].

1.2 RAD-seq技术的发展

RAD-seq技术主要包括经典的RAD-seq技术、2bRAD-seq、ddRAD-seq、ezRAD-seq技术.每种技术都各具优点和缺点(表1), 研究者可根据课题需要选择适合的RAD-seq技术.以下主要对2bRAD-seq、ddRAD-seq、ezRAD-seq 3种RAD-seq技术作简要介绍.

表1 4种RAD-seq技术的比较 Tab.1 Comparison of four RAD-seq technologies

(1) 2bRAD-seq是使用Ⅱ B型限制性内切酶来酶切产生序列一致性片段(33-36bp)的RAD-seq技术.可利用不同的接头来调节标记密度[12], 但测序片段较短, 后续分析容易受到重复序列的影响, 因此该技术不适合用于复杂度高和杂合度高的研究.

(2) ddRAD-seq是使用稀有酶和常见酶来对基因组DNA进行酶切的RAD-seq技术[11].该技术能使分子标记均匀和控制分子标记数量, 同时能消除基因组的随机剪切和末端修复, 在建库成本上只需经典RAD-seq技术费用的1/5.但获得的片段数比经典RAD-seq技术相对较少.适用于样本量较大和复杂基因组的研究.

(3) ezRAD-seq是使用测序文库试剂盒来降低实验操作复杂性的RAD-seq技术[13].该技术能迅速进入实验室操作阶段, 通过较少的实验设备和技术支持就能获得大量的数据, 能最大程度的降低实验成本.

总之, RAD-seq技术及其衍生出来的技术都各具优缺点.当实验研究需要大量遗传标记时, 可采用经典RAD-seq技术; 当涉及研究需求和经费时, 可选择ezRAD-seq和ddRAD-seq技术.此外, 除了上述描述的RAD-seq技术外, RAD-seq技术还包括quaddRAD技术[18], 该技术是基于ddRAD-seq技术发展起来的, 拥有识别和消除PCR扩增的能力, 当消除PCR扩增反应时会导致更精确的基因分型, 同时也增加了样本的多重通路作用.该技术的最大优势在于降低了实验费用、DNA起始量及实验周期, 是一种有效的基因分型方法.

2 RAD-seq技术在鱼类基因组学中的应用

近年来, 随着RAD-seq技术的不断发展, 该技术在各领域得到了广泛应用.而在鱼类中RAD-seq技术主要应用于系统发育、物种分化、遗传图谱、群体遗传、进化生物学等方面的研究.以下主要介绍RAD-seq技术在鱼类以上5个方面研究的应用, 以期为鱼类资源的保护及合理利用提供参考依据.

2.1 基于RAD-seq技术的鱼类系统发育关系的研究

过去人们主要通过形态学对鱼类系统发育关系进行研究.后来随着分子生物学的发展, 开始使用线粒体基因、核基因片段进行系统发育关系的研究.但由于形态学、分子标记不同进而导致系统发育关系的不一致, 猜测可能是由于采用的分子标记单一, 不能完整反映物种的系统发育关系.因此, 利用多种分子标记构建系统发育树来解析鱼类的系统发育关系显得十分重要.例如, Jones等[19]利用RAD-seq技术解决了先前存在争议的剑尾鱼属(Xiphophorus)的系统发育关系.

Takahashi等[20]利用形态学和RAD-seq技术对64个山鳉属(Orestias)鱼类进行研究, 证实了山鳉属鱼类的单系性, 成功解决了山鳉属鱼类的系统发育关系.许则滩[21]利用线粒体基因和RAD-seq技术解决了形态相似的鲻科(Mugilidae)鱼类系统发育关系问题.Diazarce等[16]利用RAD-seq技术显示了金枪鱼属(Thunnus)为单系群, 并非依据形态特征将其分为两个亚群的结论.

RAD-seq技术除了用于鱼类系统发育关系的研究外, 还可用于鱼类的亲缘关系和进化历史的研究.

2.2 基于RAD-seq技术的鱼类物种分化途径的研究

物种分化途径是进化生物学的核心问题之一.而物种分化途径属于同域物种分化还是异域物种分化一直以来备受争议.此外, 并不是所有鱼类物种都可以找到化石证据进行分歧年代的估算.RAD-seq技术成为解决上述问题的一种有效手段.例如, Jacobsen等[22]利用RAD-seq技术解决了欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)和美洲鳗鲡(Anguilla rostrata)的物种分化途径.Longo等[23]利用RAD-seq技术发现了海鲫科(Embiotocidae)鱼类是由北太平洋北部扩张首先在中新世中期13~18百万年前(Million years ago, Mya)的沙地和暗礁环境中分化.Gaither等[24]利用RAD-seq技术证实了刺尾鱼属(Acanthurus)物种分歧的主要动力是遗传漂变.Tariel等[25]基于RAD-seq技术发现热带东太平洋和热带西太平洋的刺蝶鱼属(Holacanthus)鱼类分歧于大约1.5 Mya, 两个群体具有不同的物种分化途径.

总之, RAD-seq技术可用于解决物种分化途径, 并对物种分歧时间进行估算.但同时还需要结合地理学和古生物学等相关知识对物种分化途径做进一步的研究.

2.3 基于RAD-seq技术的鱼类遗传图谱的研究

遗传图谱是基因或分子标记在染色体上的线性排列, 遗传连锁图谱的构建是以基因或遗传标记的重组交换为基础.遗传图谱的构建有助于发现, 与育种、生长、发育、免疫等相关的基因[26].例如, Houston等[27]利用RAD-seq技术发现了与大西洋鲑鱼(Salmo salar)养殖、育种、抗病性相关的基因.Ao等[28]利用RAD-seq技术定位到大黄鱼(Larimichthys crocea)的1274个免疫相关基因和195个低氧相关基因, 对大黄鱼的免疫抗性具有一定的应用价值.Shao等[29]利用RAD-seq技术发现了与日本牙鲆(Paralichthys olivacus)抗鳗弧菌抗性相关的tap1、stab1、cd40和cd69基因.谢蜜蜜[30]利用RAD-seq技术构建高密度遗传图谱, 为解析鲇形目鱼类生长、发育、繁殖、系统进化和环境适应机制提供了重要遗传资源.Zhang等[31]利用RAD-seq技术定位到长鳍金鲳(Trachinotus blochii)的体长、体重和体高相关基因, 对于长鳍金鲳的大小、生长和育种具有重要意义.

RAD-seq技术除了在上述鱼类遗传图谱研究中的应用外, 在其他鱼类中也得到广泛应用, 例如大菱鲆(Scophthalmus maximus)[32]、虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)[33]、伯氏妊丽鱼(Astatotilapia burtoni)[34]、红鼓鱼(Sciaenops ocellatus)[35]、斑马鱼(Danio rerio)[36]和斑点雀鳝(Lepisosteus oculatus)[37].

总之, 遗传图谱的构建对鱼类的繁殖、遗传育种、免疫、生长和环境适应具有一定的指导意义, 可为鱼类种质资源的保护提供参考依据.

2.4 基于RAD-seq技术的鱼类群体遗传的研究

群体遗传是研究群体的遗传结构及其变化规律, 旨在了解种群的种群结构、基因流、性比和有效种群大小来对遗传育种、种质资源的保护及其合理利用.例如, Catchen等[38]利用RAD-seq技术发现三刺鱼(Gasterosteus aculeatus)的河流种群明显分歧于海洋种群和淡水种群, 并证实了沿海海洋种群和沿海淡水种群之间有丰富的渐渗杂交.Candy等[39]利用RAD-seq技术发现太平洋细齿鲑(Thaleichthys pacificus)不同种群之间的基因流可能受到有限的淡水环境、局限的洄游路途和空间分布格局的影响.Pecoraro等[40]利用2bRAD-seq技术对印度洋、大西洋和太平洋的黄鳍金枪鱼(Thunnus albacores)的种群结构研究发现它们之间的黄鳍金枪鱼是独立遗传分化的.Alter等[41]利用ddRAD-seq技术揭示了刚果河丽鱼属(Teleogramma)种群分歧的主要动力是水温和地理障碍.此外, RAD-seq技术也应用于地中海鲯鳅(Coryphaena hippurus)的保护和种群性别比例的估算[42]及海湾海龙(Syngnathus scovelli)种群分化驱动力的研究[43].

2.5 基于RAD-seq技术的鱼类进化生物学的研究

进化生物学是研究生物进化的科学.研究适应性进化和平行进化会对生物进化历史有更为全面的认识.Ford等[44]利用RAD-seq技术发现纳特隆湖丽鱼种群是不完全的生殖隔离, 并且在进化过程中经历了趋异适应过程.Dibattista等[45]利用ddRAD-seq技术发现岩礁鱼类适应性进化的机制可能是种群栖息地改变所引起的.Henning等[46]利用RAD-seq技术解释了大唇朴丽鱼(Haplochromis chilotes)和红丽鱼(Pundamilia nyererei)的适应性形成过程, 并认为维多利亚湖丽鱼生态型进化的原因是分布在基因组上的多位点选择的结果.此外, RAD-seq技术在湖鳟鱼(Salvelinus namaycush)的表型平行演化[47]和海湾海龙(Syngnathus scovelli)的性别选择进化[48]中都得以应用.

2.6 基于RAD-seq技术在鱼类其他方面的研究

RAD-seq技术除了以上5个方面的研究应用外, RAD-seq技术也被用于鱼类生态基因组学的研究.生态基因组学研究的主要目的是测量人为改变环境在生物基因组选择上的影响.Laporte等[49]利用RAD-seq技术解释了北大西洋鳗鲡(欧洲鳗鲡和美洲鳗鲡)在人为有机或重金属污染下的谱系内多基因选择应答机制.使用不同的污染物对鳗鲡进行培育(同时进行对照实验)发现固醇类的调控扮演着非常重要的角色.此外, RAD-seq技术还可应用于环境对生物体表型性状改变的研究.

3 结论与展望

RAD-seq技术操作简单, 周期短, 实验成本低, 同时不受参考基因组的限制.因此该技术已成为各领域的研究热点.例如, 分子育种、基础医学研究、动植物多样性保护等领域.目前, 随着RAD-seq技术的飞速发展, RAD-seq技术在鱼类基因组中的研究也在不断推进, 并取得了一些显著性成效.如RAD-seq技术可有效解决缺乏足够遗传标记导致的系统发育关系存在争议的问题; 通过遗传图谱的构建能找出与育种、生长、发育、免疫等相关的功能基因; 同时能找出与该属鱼类与之相关的高变基因或形态特征对鱼类物种进行快速鉴别等.总之, 随着测序技术的不断发展, 测序和实验成本的进一步降低, RAD-seq技术在鱼类基因组学中的研究将会有更为广泛的应用前景, 可为鱼类资源的保护与合理的开发利用提供参考依据.

The authors have declared that no competing interests exist.

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