生防菌YN201490在黄瓜植株体内的定殖能力及防病机制的初步研究

祁超 寸海春 何鹏飞 李兴玉 吴毅歆 何鹏搏 何月秋

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生防菌YN201490在黄瓜植株体内的定殖能力及防病机制的初步研究

    作者简介: 祁超(1986−),男,河北人,硕士生,研究方向为植物病理学,E-mail: 982613602@qq.com;
    通讯作者: 吴毅歆, wyx0705@sina.com ; 何月秋, ynfh2007@163.com
  • 中图分类号: S435.621

Colonization ability in cucumber plant and biocontrol mechanism of Bacillus subtilis YN201490

    Corresponding author: WU Yi-xin, wyx0705@sina.com ;HE Yue-qiu, ynfh2007@163.com
  • CLC number: S435.621

  • 摘要: 为研究枯草芽孢杆菌YN201490在黄瓜体内的定殖能力及防病机制,采用平板对峙试验的方法测试该菌株对不同病原菌的抑制作用,利用灌根的方法研究其在黄瓜体内的定殖能力,并通过抑制孢子萌发对其发酵液进行了初步分离与活性检测. 研究通过平板对峙试验证明了枯草芽孢杆菌YN201490对小麦雪腐病菌、番茄枯萎病菌、烟草赤星病菌、玉米拟轮枝镰孢菌、茶轮斑病菌和水稻叶鞘腐败病菌有很好的抑菌活性. 用自然转化法以GFP标记,获得了荧光标记菌株YN90-P43GFPmut3a. 通过灌根法,证明该菌株能在黄瓜植株体内定殖,其数量分布为根>叶>茎. YN201490发酵液的正丁醇萃取物能裂解小麦雪腐病菌孢子,使胞质外流,抑制91.72%孢子萌发,对黄瓜白粉病的预防效果达66.26%,并能诱导黄瓜产生明显抗性. 研究结果表明枯草芽孢杆菌YN201490对多种病原真菌具有明显的抑制作用,并能够在黄瓜体内稳定定殖,具有作为生物菌剂开发利用的潜能.
  • 图 1  YN90抑菌平板对峙试验. 上排为对峙试验,下排为对照. A:小麦雪腐病菌;B:茶叶轮斑病菌;C:水稻叶鞘腐败病菌;D:玉米拟轮枝镰孢菌;E:番茄枯萎病菌;F:烟草赤星病菌;

    Figure 1.  YN90 confrontation test against plant pathogens. The upper row is the confrontation test, the lower row is the control. A: Typhula incarnata; B: Pestalotiopsis theae; C: Sarocladium oryzae; D: F. verticillioides; E: Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici; F: Alternaria alternata.

    图 2  菌株YN90-P43GFPmut3a在黄瓜体内定殖动态

    Figure 2.  Colonization dynamics of YN90-P43GFPmut3a in cucumber

    图 3  GFP标记菌株YN90在黄瓜植株体内定殖状态的切片. A~C: GFP标记菌株YN90在黄瓜植株体内定殖状态的切片(A: 根部切片;B: 茎部切片;C: 叶部切片);D~F:野生型YN90在黄瓜植株体内定殖状态的切片(D: 根部切片;E: 茎部切片;F: 叶部切片)

    Figure 3.  Cucumber tissue sections colonized by GFP-labeled YN90. A~C: GFP-labeled YN90 colonized tissues sections of cucumber plant (A: fluorescent roots;B: fluorescent stem;C: fluorescent leaves);D~F: YN90 colonized tissues sections of cucumber plant (D: fluorescent roots;E: fluorescent stem;F: fluorescent leaves)

    图 4  YN90正丁醇萃取物抑制小麦雪腐病菌试验

    Figure 4.  The n-butanol extract antibacterial test against Tyhula incarnata

    图 5  YN90不同质量浓度的正丁醇萃取物抑制小麦雪腐病菌试验. A: 1.60 mg/mL; B: 800 μg/mL; C: 400 μg/mL; D: 200 μg/mL; E: 100 μg/mL; F: CK

    Figure 5.  Different concentrations of n-butanol extract antibacterial test of YN90 against Tyhula incarnata. A: 1.60 mg/mL; B: 800 μg/mL; C: 400 μg/mL; D: 200 μg/mL; E: 100 μg/mL; F: CK

    图 6  YN90菌株发酵液正丁醇萃取物处理小麦雪腐病菌的形态变化. A: 10×观察处理后的菌丝;B: 60×观察处理后的菌丝;C: 处理后膨胀的孢子;D: 处理后死亡的孢子;E: 10×观察对照菌丝;F: 60×观察对照菌丝;G: 对照孢子;H: 处理后裂解的孢子.

    Figure 6.  Morphology changes of Typhula incarnate treated with n-butanol extract of YN90 suspension. A and B: treated hyphae under 10× and 60× magnifications; C: treated and inflated spores; D: treated and dead spores; E and F: untreated hyphae under 10× and 60× magnifications; G: control spores; H: treated and broken spores.

    图 7  YN90发酵液的正丁醇萃取物诱导黄瓜对白粉病抗性试验

    Figure 7.  The n-butanol extract induced resistance to powdery mildew of cucumber

    图 8  YN90发酵液的正丁醇萃取物处理对黄瓜白粉病的防治效果

    Figure 8.  YN90 fermentation broth of n-butanol extract on the control of cucumber powdery mildew

    图 9  正丁醇萃取物MALDI-TOF-MS质谱检测

    Figure 9.  MALDI-TOF-MS mass spectrometry of n-butanol extract

    图 10  sfpituDlpa-14基因的PCR检测

    Figure 10.  PCR profile of sfp, ituD and lpa-14 genes

    表 1  引物名称和序列

    Table 1.  Primers and sequences

    引物
    名称
    引物大小/
    bp
    引物序列
    (5′→3′)
    Sfp-f 20 ATG AAG ATT TAC GGA ATT TA
    Sfp-r 20 TTA TAA AAG CTC TTC GTA CG
    ItuD-f 21 ATG AAC AAT CTT GCC TTT TTA
    ItuD-r 20 TTA TTT TAA ATT CCG CAA TT
    Lpa-14f 20 ATG AAA ATT TAC GGA GTA TA
    Lpa-14r 20 TTA TAA CAG CTC TTC ATA CG
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    表 2  不同组分对黄瓜白粉的预防效果

    Table 2.  Prevention effect of Bacillus subtilis YN90 on cucumber powdery mildew

    萃取物 质量浓度/
    (mg·mL−1)
    病情指数 防病效果/%
    空白对照CK 60.35
    苯萃取物 4.86 60.32 0.05
    氯仿萃取物 4.72 59.94 0.68
    乙酸乙酯萃取物 4.82 59.86 0.81
    正丁醇萃取物 4.76 20.36 66.26
    水相剩余物 51.47 14.71
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-05-14
  • 录用日期:  2017-07-05
  • 网络出版日期:  2019-01-10
  • 刊出日期:  2019-01-01

生防菌YN201490在黄瓜植株体内的定殖能力及防病机制的初步研究

    作者简介:祁超(1986−),男,河北人,硕士生,研究方向为植物病理学,E-mail: 982613602@qq.com
    通讯作者: 吴毅歆, wyx0705@sina.com
    通讯作者: 何月秋, ynfh2007@163.com
  • 1. 云南农业大学 植物保护学院,云南 昆明 650201
  • 2. 微生物菌株筛选与应用技术国家地方联合共建工程中心,云南 昆明 650217
  • 3. 云南农业大学 基础与信息工程技术学院,云南 昆明 650201
  • 4. 云南农业大学 农学与生物技术学院,云南 昆明 650217

摘要: 为研究枯草芽孢杆菌YN201490在黄瓜体内的定殖能力及防病机制,采用平板对峙试验的方法测试该菌株对不同病原菌的抑制作用,利用灌根的方法研究其在黄瓜体内的定殖能力,并通过抑制孢子萌发对其发酵液进行了初步分离与活性检测. 研究通过平板对峙试验证明了枯草芽孢杆菌YN201490对小麦雪腐病菌、番茄枯萎病菌、烟草赤星病菌、玉米拟轮枝镰孢菌、茶轮斑病菌和水稻叶鞘腐败病菌有很好的抑菌活性. 用自然转化法以GFP标记,获得了荧光标记菌株YN90-P43GFPmut3a. 通过灌根法,证明该菌株能在黄瓜植株体内定殖,其数量分布为根>叶>茎. YN201490发酵液的正丁醇萃取物能裂解小麦雪腐病菌孢子,使胞质外流,抑制91.72%孢子萌发,对黄瓜白粉病的预防效果达66.26%,并能诱导黄瓜产生明显抗性. 研究结果表明枯草芽孢杆菌YN201490对多种病原真菌具有明显的抑制作用,并能够在黄瓜体内稳定定殖,具有作为生物菌剂开发利用的潜能.

English Abstract

  • 植物体内存在大量的内生微生物,它们因植物组织的保护,而免受外部恶劣环境的影响,而微生物自身活动或次生代谢产物对植物具有广泛的生物学作用[1]. 生防微生物在植物根系或植物中的定殖和消长国内外已有诸多报道,植病生防微生物的定殖能力被认为是其生防效果的重要因素之一,因此研究生防微生物在植物体内的动态就显得尤为重要. 目前用于检测内生微生物在植物体内定殖的方法主要包括抗生素标记法、基因标记法、同位素示踪法、DNA和RNA 探针法等[2-3]. 其中基因标记技术越来越成熟,如绿色荧光蛋白(GFP)标记因具有性能稳定、检测方便、灵敏度高的特点已被广泛用于观察微生物侵入植物的过程以及其在植物组织中的定殖动态[2, 4-5].

    枯草芽孢杆菌YN201490(YN90)为一株烟草内生细菌,平板对峙试验证明该菌对多种植物病原菌具有抑制作用,温室条件下对黄瓜白粉病具有良好的防治效果. 本试验通过接合转移方法将质粒P43GFPmut3a导入YN90菌株,获得绿色荧光标记菌株YN90P43GFPmut3a,实时监测其在黄瓜体内的定殖动态,并研究YN90发酵液中的不同组分预防黄瓜白粉病和诱导抗性,为进一步了解该菌株对黄瓜白粉病的防病机制和生产应用提供理论依据.

    • 供试菌株为枯草芽孢杆菌YN90. 植物病原菌小麦雪腐病菌(Typhula incarnata)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、玉米拟轮枝镰孢菌(F. verticillioides)、茶轮斑病菌(Pestalotiopsis theae)、水稻叶鞘腐败病菌(Sarocladium oryzae)均为本实验室分离保存. 含有氯霉素抗性基因的质粒P43GFPmut3a,为本实验室构建.

      供试黄瓜品种为新津研4号,购自昆明市种子市场. 供试的YN90发酵液代谢产物包括经有机溶剂苯、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物和水相剩余物共5部分.

      细菌增殖采用LB培养基. 自然转化生长培养基采用2种培养基,即枯草芽孢杆菌自然转化生长培养基Ⅰ:硫酸铵0.2%,磷酸氢二钾1.4%,磷酸二氢钾0.6%,二水柠檬酸钠0.1%,七水硫酸镁0.02%,葡萄糖0.5%,水解酪蛋白0.02%,酵母粉0.1%. 枯草芽孢杆菌自然转化生长培养基Ⅱ:硫酸铵0.2%,磷酸氢二钾1.4%,磷酸二氢钾0.6%,二水柠檬酸钠0.1%,七水硫酸镁0.02%,葡萄糖0.5%,水解酪蛋白0.004%,酵母粉0.05%.

    • 采用平板对峙[6]试验的方法,以上述6种病原真菌作为测试材料,用生防菌处理与对照菌落抑菌圈面积大小对比的方法,检测其抑菌活性,每组试验5个平板,每组重复3次.

    • 参照李瑞芳等[7]提出的方法,略有改动,自然转化YN90菌株. 将转化成功的克隆菌株经不含氯霉素的LB培养液和平板交替继续培养3轮,再回接到含氯霉素的LB平板上检测,以检验质粒表达的稳定性.

    • 盆栽黄瓜各10盆,每盆中保留黄瓜幼苗3~4株,在黄瓜幼苗长到4~5片真叶时,用荧光菌株YN201490P43mut3a的发酵液做灌根处理,发酵液的浓度为1.27×106 cfu/mL,每盆灌根处理所用发酵液的量为100 mL. 分别于处理后第 1、2、4、6、8、40 天取样,每次随机选取3株黄瓜,测定拮抗细菌在黄瓜根、茎、叶内的定殖情况,以纯培养基为对照,每个试验重复3次. 选取处理5 d后的黄瓜根、茎、叶组织,以清水洗净后切片,以压片法制片,在激光扫描共聚焦显微镜(Lrica, DE)下观察 GFP 标记菌株在黄瓜体内的定殖情况.

    • 用YN90发酵液萃取得到的不同组分处理黄瓜幼苗(萃取物浓度见表2),24 h后采用孢子悬浮液喷雾法接种白粉病菌,白粉病孢子悬浮液的浓度为4~10×104 cfu/mL,7 d后观察其发病情况,分级标准和防治效果计算方法参考国家田间药效试验准则. 为了测试萃取物是否对黄瓜白粉病具有诱导抗性,采用叶片遮挡法,即在同一株黄瓜上,用塑料袋罩住黄瓜植株的部分叶片,用萃取物喷施黄瓜植株(以表面湿润为度,萃取物浓度见表2),24 h后接种白粉病菌(接种浓度同上),7 d后观察各叶片发病情况.

    • 利用MALDI-TOF-MS技术检测正丁醇萃取物中物质的相对分子质量. 洗脱液A:2%乙腈、0.09%甲酸、0.01%乙酸水;洗脱液B:95%乙腈、0.09%甲酸、0.008 5%乙酸水. 洗脱程序为:2%洗脱液B洗脱2 min,洗脱液B从2%到70%洗脱20 min,从70%到90%洗脱2 min,从70%到2%洗脱1 min,2%洗脱20 min.

    • 参照Hsieh等[9]的报道,扩增表面活性素生成相关基因sfp,扩增程序:94 ℃变性1 min,46 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共25个循环. 重复3次. 参照Hsieh等[10]的另一报道,扩增伊枯草菌素 A生成相关基因ituDlpa14,扩增程序:94 ℃变性1 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,共30个循环. 重复3次. 引物设计如表1,PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测.

      引物
      名称
      引物大小/
      bp
      引物序列
      (5′→3′)
      Sfp-f 20 ATG AAG ATT TAC GGA ATT TA
      Sfp-r 20 TTA TAA AAG CTC TTC GTA CG
      ItuD-f 21 ATG AAC AAT CTT GCC TTT TTA
      ItuD-r 20 TTA TTT TAA ATT CCG CAA TT
      Lpa-14f 20 ATG AAA ATT TAC GGA GTA TA
      Lpa-14r 20 TTA TAA CAG CTC TTC ATA CG

      表 1  引物名称和序列

      Table 1.  Primers and sequences

    • 平板对峙试验中,该菌株对小麦雪腐病菌、番茄枯萎病菌、烟草赤星病菌、玉米拟轮枝镰孢菌、茶轮斑病菌、水稻叶鞘腐败病菌表现出良好的抑菌效果,在每个抑菌平板上都形成了明显的抑菌带,带宽均大于2 mm(图1). 通过菌落面积的测算分析,该菌株对水稻叶鞘腐败病菌的抑制率高达84.48%,抑制率最低的番茄枯萎病菌,为46.14%,对其他病原菌的抑制率均大于60.00%. 结果说明该菌株具有很强的抑菌活性,具有开发利用潜力.

      图  1  YN90抑菌平板对峙试验. 上排为对峙试验,下排为对照. A:小麦雪腐病菌;B:茶叶轮斑病菌;C:水稻叶鞘腐败病菌;D:玉米拟轮枝镰孢菌;E:番茄枯萎病菌;F:烟草赤星病菌;

      Figure 1.  YN90 confrontation test against plant pathogens. The upper row is the confrontation test, the lower row is the control. A: Typhula incarnata; B: Pestalotiopsis theae; C: Sarocladium oryzae; D: F. verticillioides; E: Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici; F: Alternaria alternata.

    • 参照李瑞芳等提出的方法成功将质粒P43GFPmut3a导入YN90中,获得标记菌株YN90-P43GFPmut3a. 灌根处理1d后,在黄瓜的根、茎、叶中均能检测到标记菌株,其菌量分布为根>叶>茎,菌量于茎和叶中的第4天左右出现峰值,此后略有下降,最后趋于平稳(图2). 灌根处理第5天,取黄瓜根、茎、叶的组织切片,以观察其在植株内的定殖状态(图3). 在处理40 d后,在根际土、根、茎和叶中仍可检测到标记菌株. 结果说明来自烟草内生菌株YN90在黄瓜植株内也具有良好的定殖能力.

      图  2  菌株YN90-P43GFPmut3a在黄瓜体内定殖动态

      Figure 2.  Colonization dynamics of YN90-P43GFPmut3a in cucumber

      图  3  GFP标记菌株YN90在黄瓜植株体内定殖状态的切片. A~C: GFP标记菌株YN90在黄瓜植株体内定殖状态的切片(A: 根部切片;B: 茎部切片;C: 叶部切片);D~F:野生型YN90在黄瓜植株体内定殖状态的切片(D: 根部切片;E: 茎部切片;F: 叶部切片)

      Figure 3.  Cucumber tissue sections colonized by GFP-labeled YN90. A~C: GFP-labeled YN90 colonized tissues sections of cucumber plant (A: fluorescent roots;B: fluorescent stem;C: fluorescent leaves);D~F: YN90 colonized tissues sections of cucumber plant (D: fluorescent roots;E: fluorescent stem;F: fluorescent leaves)

    • 鉴于萃取物中的其他部分没有防治黄瓜白粉病的功能,为了研究正丁醇萃取物的作用机制,对该组分进行了抑菌试验和诱导抗性试验. 在对植物病原菌的抑菌试验中,因黄瓜白粉病菌为植物专性寄生菌,不能人工培养的特点,选用小麦雪腐病菌作为指示菌株. 结果表明,经该组分处理后(质量浓度为1.64 mg/mL),小麦雪腐病菌菌落向外延伸的距离平均只有0.1 cm,对照组的菌落向外延伸的距离达到1.9 cm(图4),抑制率达94.37%. 进一步探究正丁醇萃取物的最低抑菌浓度,结果显示在质量浓度为200 μg/mL对小麦雪腐病菌的生长依然具有良好的抑制效果(图5),抑制率为86.7%,进一步观察发现该组分能够裂解小麦雪腐病菌分生孢子及破坏细胞壁的完整性,使细胞质外流(图6).

      图  4  YN90正丁醇萃取物抑制小麦雪腐病菌试验

      Figure 4.  The n-butanol extract antibacterial test against Tyhula incarnata

      图  5  YN90不同质量浓度的正丁醇萃取物抑制小麦雪腐病菌试验. A: 1.60 mg/mL; B: 800 μg/mL; C: 400 μg/mL; D: 200 μg/mL; E: 100 μg/mL; F: CK

      Figure 5.  Different concentrations of n-butanol extract antibacterial test of YN90 against Tyhula incarnata. A: 1.60 mg/mL; B: 800 μg/mL; C: 400 μg/mL; D: 200 μg/mL; E: 100 μg/mL; F: CK

      图  6  YN90菌株发酵液正丁醇萃取物处理小麦雪腐病菌的形态变化. A: 10×观察处理后的菌丝;B: 60×观察处理后的菌丝;C: 处理后膨胀的孢子;D: 处理后死亡的孢子;E: 10×观察对照菌丝;F: 60×观察对照菌丝;G: 对照孢子;H: 处理后裂解的孢子.

      Figure 6.  Morphology changes of Typhula incarnate treated with n-butanol extract of YN90 suspension. A and B: treated hyphae under 10× and 60× magnifications; C: treated and inflated spores; D: treated and dead spores; E and F: untreated hyphae under 10× and 60× magnifications; G: control spores; H: treated and broken spores.

      YN90萃取物的对黄瓜白粉病的预防结果(表2)表明,正丁醇萃取物对黄瓜白粉病的防效达到了66.26%,这一结果与该菌株防治白粉病64.84%的效果基本一致[11],而其他萃取组分几乎没有防治效果,此结果说明发酵液的主要活性物质存在于正丁醇萃取物部分.

      萃取物 质量浓度/
      (mg·mL−1)
      病情指数 防病效果/%
      空白对照CK 60.35
      苯萃取物 4.86 60.32 0.05
      氯仿萃取物 4.72 59.94 0.68
      乙酸乙酯萃取物 4.82 59.86 0.81
      正丁醇萃取物 4.76 20.36 66.26
      水相剩余物 51.47 14.71

      表 2  不同组分对黄瓜白粉的预防效果

      Table 2.  Prevention effect of Bacillus subtilis YN90 on cucumber powdery mildew

      在对黄瓜诱导抗性试验中,经正丁醇萃取物部分诱导过的黄瓜植株发病情况比没有处理的明显减轻(图7),说明该活性组分能够诱导黄瓜产生系统抗性. 重复上述试验,在接种白粉病菌21 d后观察黄瓜白粉病的发病情况,经正丁醇萃取物处理过的黄瓜植株的发病情况明显要轻于对照组(图8). 综合上述实验结果说明该组分对植物病原菌既有直接的抑制作用,又可以诱导植物产生系统性抗性.

      图  7  YN90发酵液的正丁醇萃取物诱导黄瓜对白粉病抗性试验

      Figure 7.  The n-butanol extract induced resistance to powdery mildew of cucumber

      图  8  YN90发酵液的正丁醇萃取物处理对黄瓜白粉病的防治效果

      Figure 8.  YN90 fermentation broth of n-butanol extract on the control of cucumber powdery mildew

    • 正丁醇萃取物经MALDI-TOF-MS检测发现分别在m/z=1 008.641 7~1 036.649 4和m/z=1 044.601 7~1 072.700 8具有吸收峰(图9),根据已报道的化合物推测它们分别为表面活性素和伊枯草菌素的质子叠加峰. 为进一步证明其中是否含有该组物质,对分泌该物质的相关基因进行了检测,以YN90基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得3条特异性条带,大小约为675、675 bp和1 203 bp(图10),结果说枯草芽孢杆菌YN90的基因组中存在相关基因,具有分泌表面活性素和伊枯草菌素的能力.

      图  9  正丁醇萃取物MALDI-TOF-MS质谱检测

      Figure 9.  MALDI-TOF-MS mass spectrometry of n-butanol extract

      图  10  sfpituDlpa-14基因的PCR检测

      Figure 10.  PCR profile of sfp, ituD and lpa-14 genes

    • 植物内生菌的防病机理主要通过与病原菌竞争生态位和营养物质、产生抗菌物质以及诱导植物产生系统抗性等作用方式[16]. 植株病原菌入侵植物时需要一定的生存空间和营养物质,内生细菌通过与病原菌竞争相同的生态位和营养物质从而防止病害的发生[17-18]. 吴蔼民等[19]认为从棉花植株的维管束中分离得到的内生细菌对棉花黄萎病具有防治作用,是因为其在植物体内有稳定的生存空间,从而能够抑制棉花黄萎病菌的入侵. 定殖于植物组织中的内生细菌,有些能够产生抗菌活性物质,这些物质对于抑制病原菌的入侵,孢子的萌发及病害的蔓延具有重要作用. Miller等[20]发现,定殖于草本植物叶子和组织内的黄绿假单胞菌产生抗菌物质生态菌素(ecomycins),该物质对植物病原菌微荚膜新隐球酵母和白色念珠菌具有明显抑制作用. 韩琴等[21]研究发现解淀粉芽孢杆菌分泌的脂肽类伊枯草菌素(iturins)能够通过作用于真菌的信号通路,造成大丽轮枝菌细胞壁破裂、细胞质外流及细胞壁的完整性受到破坏,也能参与由病原相关分子的模式引发的免疫过程的植物防卫应答. 诱导抗性作为植物与内生菌相互作用的主要机制已被广泛研究[22-23]. Sturz等[24]研究表明,植物自身的防卫应答可能与内生细菌在宿主内的定殖相关.

      诸多研究结果表明生防菌是否能够在宿主植物中稳定定殖并维持一定数量是其发挥防病促生作用的重要前提[12-14]. Bull等[15]报道了荧光假单胞2-79在小麦植株不同部位定殖量与小麦全蚀病发病情况呈负相关,小麦全蚀病的病情指数随着生防菌2-79在小麦植株内的定殖量增加而降低. 枯草芽孢杆菌YN201490为1株烟草内生菌,在实验条件下对多种植物病原菌表现出明显的抑制效果,温室条件下对黄瓜白粉病的防治效果达到66.26%. 通过GFP标记菌株研究了其在黄瓜体内的定殖情况,结果显示其能够在黄瓜体内稳定定殖,定殖量维持在103~104 cfu/g鲜重,而烟草和黄瓜不属于同科作物,前述其他人均是采用自身内生菌做宿主的防病试验,没有或很少有关于非宿主内生菌定殖和防病的报道. 本实验的结果预示着该菌株可能具有更为广泛的应用前景. 通过对其发酵液的初步分离及活性检测,发现其活性成分主要存在于正丁醇萃取物部分,该组分能直接抑制真菌孢子的萌发并使其发生裂解,破坏真菌细胞壁的完整性使细胞畸变及胞质外流,且在盆栽实验中对黄瓜白粉病的预防效果达66.26%. 在诱导抗性试验中,经该组分诱导过的黄瓜植株发病情况明显减轻. 利用MALDI-TOF-MS检测技术进一步分析,推测该组分中含有表面活性素和伊枯草菌素,并通过相关基因的检测从侧面证实了这一推测的准确性. 不过,正丁醇萃取物还是一类混合物,从MALDI-TOF-MS图谱分析,表面活性素和伊枯草菌素的吸收强度也相对较弱,在抑菌和生防作用中是不是起主要作用,还需要进步一研究.

参考文献 (24)

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