草莓病毒病及其研究进展

苏代发 童江云 杨俊誉 陈杉艳 罗志伟 沈雪梅 赖泳红 JamilArslan 魏世杰 崔晓龙

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草莓病毒病及其研究进展

    作者简介: 苏代发(1994−),男,云南人,硕士生,主要从事野生生物种质资源方面的研究;
    通讯作者: 魏世杰, shijie.wei@aliyun.com ; 崔晓龙, xlcui@ynu.edu.cn
  • 中图分类号: S432.1

Strawberry viruses diseases and its research advances

    Corresponding author: WEI Shi-jie, shijie.wei@aliyun.com ;CUI Xiao-long, xlcui@ynu.edu.cn
  • CLC number: S432.1

  • 摘要: 对草莓镶脉病毒(strawberry vein banding virus, SVBV)、草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus, SMoV)、草莓皱缩病毒(strawberry crinkle virus, SCV)、草莓轻型黄边病毒(strawberry mild yellow edge virus, SMYEV)和草莓潜隐环斑病毒(strawberry latent ringspot virus, SLRSV)等5种草莓主要病毒的分类、分布及生物学特性进行了综述. 在此基础上,对草莓病毒的检测方法(指示植物检测、电镜检测、血清学检测和分子生物学检测)、传播媒介(蚜虫、蓟马、粉虱、线虫和真菌)、脱毒方法(高温脱毒、化学试剂脱毒、茎尖脱毒、高温-茎尖结合脱毒和超低温脱毒)及草莓病毒病的防治(脱毒苗运用、田间管理、抗病毒品种和阻断传播媒介)等方面进行了论述,以期为草莓生产中病毒病的防治提供科学依据.
  • 图 1  草莓病毒检测小叶接种法示意图[23]

    Figure 1.  Schematic diagram of leaflet graft bioassay to detection strawberry virus

    图 2  草莓病毒检测匍匐茎接种法示意图[23]

    Figure 2.  Schematic diagram of stolon bioassay to detection strawberry virus

    表 1  5种病毒的常规比较

    Table 1.  Conventional comparison of 5 strawberry viruses

    比较条目SVBVSMoVSCVSMYEVSLRSV
    病毒粒子形态球形球形弹状线性未描述
    分布全球全球全球全球欧美地区
    遗传物质环状双链DNA两条正链RNA单链RNA单链RNA双链RNA
    传播方式主要通过草莓钉毛蚜,也可经嫁接等传播,无法通过汁液、种子和花粉传播主要通过草莓钉毛蚜等传播,也可经机械接种、嫁接侵染,无法经种子和植株接触传播可通过草莓钉毛蚜、汁液和嫁接等传播,无法经种子和花粉传播主要通过草莓钉毛蚜等传播,也可经汁液传播,无法经种子和花粉通过长剑线虫、嫁接、汁液和种子传播
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-11-09
  • 录用日期:  2019-07-12
  • 网络出版日期:  2019-10-15
  • 刊出日期:  2019-11-01

草莓病毒病及其研究进展

    作者简介:苏代发(1994−),男,云南人,硕士生,主要从事野生生物种质资源方面的研究
    通讯作者: 魏世杰, shijie.wei@aliyun.com
    通讯作者: 崔晓龙, xlcui@ynu.edu.cn
  • 1. 云南大学 生命科学学院,云南 昆明 650091
  • 2. 昆明市农业科学研究院,云南 昆明 650034

摘要: 对草莓镶脉病毒(strawberry vein banding virus, SVBV)、草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus, SMoV)、草莓皱缩病毒(strawberry crinkle virus, SCV)、草莓轻型黄边病毒(strawberry mild yellow edge virus, SMYEV)和草莓潜隐环斑病毒(strawberry latent ringspot virus, SLRSV)等5种草莓主要病毒的分类、分布及生物学特性进行了综述. 在此基础上,对草莓病毒的检测方法(指示植物检测、电镜检测、血清学检测和分子生物学检测)、传播媒介(蚜虫、蓟马、粉虱、线虫和真菌)、脱毒方法(高温脱毒、化学试剂脱毒、茎尖脱毒、高温-茎尖结合脱毒和超低温脱毒)及草莓病毒病的防治(脱毒苗运用、田间管理、抗病毒品种和阻断传播媒介)等方面进行了论述,以期为草莓生产中病毒病的防治提供科学依据.

English Abstract

  • 草莓(strawberries)属于蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria L.),在园艺学上属于浆果类果树[1],其果肉鲜美,含有特殊的浓郁芳香,具有较高的营养价值,素有“水果皇后”之美称,是深受人们喜爱的时令水果之一. 因其具有适应性广、结果早、生长周期短等特点,在全球范围内广泛种植,是一种重要的经济作物.

    为保证草莓品种的优良性状,草莓主要是用匍匐茎进行无性繁殖,而多年无性繁殖造成病毒在草莓体内积累且世代相传,使草莓病毒危害愈加严重[2]. 草莓病毒病能致使草莓果小、畸形、品质差、叶子皱缩、生长缓慢、产量大减[3]. 据不完全统计,草莓病毒的种类多达62种[4],且新的病毒不断被报道,其中分布广泛、危害严重的草莓病毒包括草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus, SMoV)、草莓轻型黄边病毒(strawberry mild yellow edge virus, SMYEV)、草莓镶脉病毒(strawberry vein band virus, SVBV)、草莓皱缩病毒(strawberry crinkle virus, SCV)和草莓潜隐环斑病毒(strawberry latent ringspot virus, SLRSV)等5种[5-7].

    草毒植株本身对病毒没有免疫能力,目前又没有特效药剂或方法治愈病毒病,实现草莓无病毒栽培的唯一有效途径就是脱除其植株中的病毒,获得无病毒原种母株,然后进行无病毒苗的大量繁育,以满足生产需求[8]. 自20世纪30年代以来,世界上许多国家都开展了草莓病毒病的研究,对草莓病毒病的发生特点、主要种类、地理分布、传播途径、脱毒方法、病毒检测、鉴定方法及无病毒苗的培育等进行了研究. 我国在此方面研究较晚,始于20世纪80年代,北京市农林科学院、中国农业科学院、沈阳农业大学等单位较早开展了利用草莓茎尖分生组织培养、花药组织培养、热处理等方法进行草莓脱毒研究工作,但直至20世纪90年代,我国草莓脱毒技术才应用于生产[9]. 本文对主要草莓病毒病及其分布、病毒检测、发病特点及防治措施的研究进展进行了综述.

    • SVBV为单分子环状双链DNA病毒,属花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)、花椰菜病毒属(Caulimovirus[10],毒粒子呈球形,直径为45~50 nm,该病毒主要在细胞质内复制,叶片、表皮、与木质部相连的导管和细胞质中均有病毒存在. 1952年在英国从美国、巴西引进的草莓品种Fairfax上首次发现. 全球范围内均有报道[5]. 该病毒为半持久性蚜传病毒,可通过草莓钉毛蚜等传播,也可通过嫁接传播;该病毒不能在传播媒介中复制,无法通过传播媒介后代传递;不能通过机械接种(汁液)传播,种子和花粉也不传播[11]. SVBV全基因组测序工作已完成,基因组约7 876 个核苷酸(nucleotide,nt),有7个开放阅读框(open reading frame,ORF):ORF1编码产物与运动有关,ORF2编码产物与蚜传病毒有关,ORF3编码产物为DNA结合蛋白,ORF4编码产物为病毒粒子外壳蛋白前体,ORF5编码产物为病毒粒子内逆转录酶合成前体,ORF6编码产物病毒内基质形成及寄主病症有关,ORF7编码产物其功能尚不明确[11]. Feng等[12]以栽培种草莓Fragaria × ananassa cv. Sachinoka为材料,从草莓植株上得到了SVBV的中国分离株(SVBV-CN),对SVBV-CN基因组测序后发现,其基因组由7 864个核苷酸组成,该分离株的核酸序列与美国分离株(SVBV-US)的核酸序列相似性达85.8%. Dickison等[13]从加拿大东部的Nova Scotia地区得到了SVBV的分离株NS8,对NS8分离株测序后发现,该分离株基因组由7 856个核苷酸组成,有7个ORF. 用现有的ORF4序列进行系统发育分析表明:所有加拿大分离株聚为一个分支,来自欧洲、埃及和美国的分离株聚为一个分支,来自中国的分离株聚为一个分支.

    • SMoV属伴生豇豆病毒科(Secoviridae)、Sadwavirus病毒属[10],病毒粒子为球形,直径28~30 nm,叶表皮、韧皮部和薄壁细胞中都有病毒存在. 该病毒1938年首次在英格兰凤梨草莓上发现,目前在草莓栽培区广泛分布. SMoV为半持久性蚜传病毒,主要通过草莓钉毛蚜等传播;机械接种、嫁接也可传染;但是草莓种子不能传染,植株相互接触也不能传染. 感染森林草莓的主要症状为:叶脉透明、脉序混乱,叶片褪绿斑驳,植株矮化;病症在不同的季节有所不同或无症状,但能导致植株长势衰弱,产量降低[11]. Thompson等[14]于2002年对SMoV基因组进行了报道,其基因组由两条正链RNA组成,RNA1长7 036个核苷酸,RNA2长5 619个核苷酸,分别包括了3’端poly(A)尾. RNA1编码的多聚蛋白由旋转酶、连接蛋白、蛋白酶和复制酶组成,而RNA2编码的多聚蛋白推测包含运动蛋白和外壳蛋白. Bhagwat等[15]从New Brunswick地区草莓种植园里得到了SMoV病毒的分离株NB926,对其基因组进行测序后发现,该分离株RNA1由7 008~7 043个核苷酸组成,这与Thompson等报道RNA1核苷酸组成很接近;RNA2由6 319~6 340个核苷酸组成,这明显比Thompson等报道的5 619个核苷酸要长.

    • 1932年SCV首次在美国被报道,现世界范围内皆有分布,SCV为负义单链RNA(negative-sense single-strand RNA)病毒,属弹状病毒科(Rhabdoviridae)、细胞质弹状病毒属(Cytorhabdovirus[10],病毒粒子为弹状,宽74~78 nm,长163~383 nm[11]. 该病毒可通过草莓钉毛蚜等昆虫持久性传播,能在昆虫体内繁殖,机械接种(汁液)传播和嫁接传播;植株相互接触不能传染,种子和花粉也不传播. SCV的基因组共14 547个核苷酸,有7个ORF,编码4个蛋白,分别为核壳蛋白、基质蛋白、糖蛋白和L蛋白. Koloniuk等[16]以栽培种草莓Fragaria × ananassa cv. Čačanská raná为材料,从草莓植株上分离了SCV病毒的两个分离株并分别对其基因组进行测序,发现分离株ČR-A和ČR-B的基因组分别由14 545个核苷酸和14 559个核苷酸组成,这一结果与前人的报道很接近.

    • 草莓轻型黄边病最早由Horn于1922年在美国加州发现,北美、欧洲、澳大利亚、日本等相继有报道,目前在世界上分布广泛. SMYEV为单链正义RNA(single-stranded positive-sense RNA)病毒[17],属甲型线性病毒科(Alphaflexiviridae)、马铃薯X病毒属(Potexvirus[10],毒粒子为线形,长482 nm,宽13 nm. 病毒主要通过草莓钉毛蚜等以持久性方式传播;病毒在传播媒介中不能复制,也不能通过媒介后代传递[11];不能通过机械传播,可通过注射病汁液接种;植物间接触不可传播,种子和花粉也不传播. 该病毒分离株MY18基因组约为5 966 nt,共有6个ORF:ORF1编码与聚合酶相关蛋白,ORF2、ORF3和ORF4编码与运动相关蛋白,ORF5主要编码病毒的外壳蛋白,ORF6编码产物功能尚未明确[11]. Thompson等[18]得到了SMYEV的分离株D74并对其基因组进行测序. D74基因组由5 970个核苷酸(不包括3’端poly(A)尾),这与MY18的序列很相近,两个分离株的核苷酸序列的同源性为85.7%. D74有5个ORF:ORF1编码RNA依赖性的RNA聚合酶,与MY18有96.3%的氨基酸序列同源性;ORF2编码一个由229个氨基酸组成,相对分子质量为25 447 u的蛋白质,氨基酸序列与MY18的同源性为95.6%;ORF3编码一个由108个氨基酸组成,相对分子质量为11 584 u的蛋白质,与MY18的序列同源性为97.2%;ORF4编码一个由75个氨基酸组成,相对分子质量为7 977 u的蛋白质,氨基酸序列与MY18的同源性为94.7%;ORF5编码一个由242个氨基酸组成,相对分子质量为25 718 u的衣壳蛋白,其氨基酸序列与MY18的同源性为95.5%. Bhagwat等[19]从加拿大东部分离得到草莓轻型黄边病毒的4个分离株AB41-01、AB41-02、NB1165和NS26,经核苷酸测序后,发现这4个分离株与SMYEV分离株MY18和D74的核酸序列相似性为83.5%~89.9%.

    • SLRSV属伴生豇豆病毒科(Secoviridae)、线虫传多面体病毒属(Nepovirus[10],主要分布在欧洲、美国、俄罗斯等地区. SLRSV主要通过长剑线虫(Xiphinema sp.)传播,机械、嫁接、种子均可传播[5]. SLRSV能侵染种子、种球、块茎和苗木等[20],病毒侵染植株后,主要表现为叶片褪绿、畸形、植株矮化、产量以及品质下降等现象,严重时可引起毁灭性灾害[21]. SLRSV基因组包括两条RNA链,RNA1由7 496个核苷酸组成、RNA2由3 842个核苷酸组成,其中都不包括poly(A)尾,RNA1编码一种具有在其他类似微生物的植物病毒中发现的特征性酶基序的多聚蛋白,RNA2编码被加工为假定运动蛋白和病毒两种外壳蛋白的多聚蛋白[22].

      表1从病毒粒子形态、分布、遗传物质和传播方式等方面对5种病毒进行了比较,使读者能清晰、明了地对草莓主要病毒有所了解。由表1可知,这5种病毒中有4种属于RNA病毒;病毒粒子形态多样,有球形、弹状、线性等;就其分布而言,有4种病毒在全球范围内都有分布,而草莓潜隐环斑病毒则分布于欧美地区;其传播方式也多样,主要通过草莓钉毛蚜等传播,同时汁液、嫁接等方式也可传播病毒。

      比较条目SVBVSMoVSCVSMYEVSLRSV
      病毒粒子形态球形球形弹状线性未描述
      分布全球全球全球全球欧美地区
      遗传物质环状双链DNA两条正链RNA单链RNA单链RNA双链RNA
      传播方式主要通过草莓钉毛蚜,也可经嫁接等传播,无法通过汁液、种子和花粉传播主要通过草莓钉毛蚜等传播,也可经机械接种、嫁接侵染,无法经种子和植株接触传播可通过草莓钉毛蚜、汁液和嫁接等传播,无法经种子和花粉传播主要通过草莓钉毛蚜等传播,也可经汁液传播,无法经种子和花粉通过长剑线虫、嫁接、汁液和种子传播

      表 1  5种病毒的常规比较

      Table 1.  Conventional comparison of 5 strawberry viruses

    • 指示植物检测鉴定是指通过指示植物对某种或几种病毒及类似病原物敏感的特性,能较快地显现出特有症状的检测鉴定方法. 其中,森林草莓(Fragaria vesca L.)中的UC4、UC5、UC6、EMC、AIP和弗州草莓(Fragaria virginiana Miller)中的UC10、UC11、UC12被认定为草莓病毒鉴定的理想指示植物[23].

    • 操作详见图1[23],接种1~2个月后,如有病毒侵染,可从新展开的叶片或老叶片上看出病症. 此种检测方法对操作人员有严格要求,嫁接后的成活率直接影响着最终的检测结果.

      图  1  草莓病毒检测小叶接种法示意图[23]

      Figure 1.  Schematic diagram of leaflet graft bioassay to detection strawberry virus

      韩荣华[24]于2016年用小叶嫁接法对草莓病毒症状进行了鉴定,在综合比较指示植物的症状后,发现检测草莓轻型黄边病毒用指示植物UC10效果较好;检测草莓斑驳病毒、草莓镶脉病毒用UC5较好.

    • 选择被检植株和指示植物的粗壮匍匐茎,按图2中(A) → (B)的顺序将两条匍匐茎嫁接起来,6周后在图2中“×”处剪断,如果被检测的子苗生长正常,说明嫁接成功,可以在指示植物上观察病症(详见图2[23]. 该方法同样对操作人员有严格要求,嫁接后的匍匐茎的成活率直接影响着最终的检测结果.

      图  2  草莓病毒检测匍匐茎接种法示意图[23]

      Figure 2.  Schematic diagram of stolon bioassay to detection strawberry virus

      王国平等[25]研究发现,在实际鉴定中草莓多为几种病毒复合侵染,症状表现变化较大,且不同时期指示植物上的症状表现也有差异,从而增加了检测难度. Montasser等[26]研究认为,SMYEV局限于植物韧皮部,且在植物体内含量极低,用通常的鉴定方法灵敏性不足. 由此可见,传统的指示植物鉴定法进行病毒鉴定时操作性难度较高,故而较难于推广.

    • 目前,通常认为运用负染和超薄切片电镜[20]观察能够诊断和鉴别植物病毒,一般可诊断到属的水平. 在植物病毒的诊断和形态鉴别中,最有用的特征是病毒粒子的形态结构和寄主病变,有些细胞病变特征还能用于区分不同的病毒种甚至株系[11]. 20世纪80—90年代,认识草莓病毒病,鉴定脱毒效果均采用电镜观察法. 王国平等[27]用电镜法观察到草莓斑驳病毒、草莓轻型黄边病毒和草莓镶脉病毒均为球状病毒,病毒粒子直径分别为25~30、23 nm和50 nm;皱缩病毒为杆状病毒,大小为380 nm × 70 nm. 肖文斐等[28]同样用透射电镜观察了草莓镶脉病毒,在透射电镜下观察到病毒粒子为球形,直径约为40~55 nm,这与王国平等的结果相一致. 吴元华等[29]用电镜法在国内首次观察到草莓伪轻型黄边病毒为线形晶状病毒粒子,分散或聚集于寄主的薄壁组织细胞质中,草莓轻型黄边病毒为球形粒子.

      应用电镜方法鉴定和检测植物病毒,这种方法对初学者来说掌握的难度比较大,且往往容易受到破碎的植物细胞器的干扰而影响判断的结果. 新近流行的冷冻电镜,由于其快速冷冻技术可使水在低温状态下呈玻璃态,减少冰晶的产生,从而不影响样品本身结构,且冷冻传输系统能保证在低温状态下对样品进行电镜观察,适于观察生物样品,有望引进并用于相关研究工作.

    • 据马崇坚[4]报道,由于不同的病毒刺激所产生的抗血清都有各自的特异性,所以可以用已知病毒的抗血清检测出未知病毒的种类. 抗血清在病毒检测中已成为一种高度专化的试剂,因其特异性强、检测速度快,是一种比较理想的病毒检测方法. 用已知病毒的抗血清来检测病毒的存在与否以及病毒的种类,其中最为常用的是酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),目前已有14种草莓病毒或类似病毒可用ELISA进行检测[30-31].

      传统的病毒抗血清制备是以纯化病毒粒体为抗原,SMYEV在植株内含量较低,因此病毒粒子的纯化很困难;而以原核表达病毒外壳蛋白(coat protein,CP)为基础的抗血清制备,克服了传统方法中通过提纯病毒粒体并以其作为抗原制备抗血清的种种弊端,能够大量获得特异性高的抗血清. 国内学者近年来也开展了利用原核表达诱导表达的CP基因制备植物病毒抗血清的研究工作,Petrovic等利用原核表达策略制备了沙地葡萄茎痘伴随病毒 (rupestris stem pitting associated virus, RSPaV) 的抗血清,王振东等制备了马铃薯Y病毒 (potato virus Y, PVY)的抗血清,蔡瑜等制备了苹果褪绿叶斑病毒 (apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV) 的抗血清,李丽丽等制备了苹果茎痘病毒 ( apple stem pitting virus, ASPV) 的抗血清[32]. 代红艳等[33]在原核细胞中建立用以表达SMYEV的外壳蛋白,并以该外壳蛋白为抗原制备SMYEV抗血清,建立了用ELISA检测SMYEV的技术体系.

      血清学方法的缺点是检测每种病毒都需要制备相应的酶标记特异抗体,且标记过程比较复杂. 我国草莓病毒研究起步较晚,草莓病毒中只有SMYEV和SCV的抗血清被制备,而且效果并不好,故而血清学鉴定在国内草莓病毒检测中目前很少应用.

    • 分子生物学检测法是通过检测病毒核酸来证实病毒的存在. 此方法比血清学方法的灵敏度还要高(能检测到皮克(1 pg=10−12 g)甚至飞克(1 fg=10−15 g)水平的病毒),特异性强,有着更快的检测速度,操作也比较简便,可用于大量样品的检测. 分子生物学检测技术主要有PCR技术、分子杂交技术、dsRNA技术、NASBA技术.

    • 20世纪末以来,许多发达国家开始采用PCR技术检测草莓病毒,并取得了很好的效果. 由于绝大多数植物病毒核酸是RNA,在进行PCR检测前,需以RNA为模板,经逆转录生成cDNA后,再以cDNA链为模板进行PCR反应. 该项技术称为反转录-多聚酶链式反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR),现已是检测植物RNA病毒的重要手段之一. Thompson等[14]对SMoV基因组进行测序,为分子水平检测草莓病毒奠定了理论基础. Hadidi等[34]利用RT-PCR测出SMYEV的cDNA长度,其大小约为500 bp(base pair, bp),Jelkmann等[35]先后测出SPMYEV的全长cDNA序列. 陈晓军等[36]用RT-PCR建立了能同时对SMoV、SVBV、SCV和SMYEV等4种草莓病毒进行检测的方法. 王运生等[37]用RT-PCR对SMoV、SMYEV、SVBV、SCV和黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus, CMV)5种草莓病毒进行检测,发现SVBV普遍发生,而SCV则很少检测到. Bartsch等[38]以冷冻草莓为材料,建立了检测GII型诺如病毒的RT-PCR体系.

      为了提高检测的稳定性和检测效率,免疫捕获PCR(IC-PCR)、巢式PCR (nested-PCR)、PCR-ELISA、实时荧光PCR、多重PCR等一些新的PCR技术被应用于草莓病毒检测中. IC-PCR利用抗血清捕获病毒粒子后,再进行PCR扩增,解决了病毒含量低和核酸纯度低影响扩增的问题;IC-PCR技术已被用于检测苹果褪绿叶斑病毒 (apple chlorotic leafspot virus, ACLSV)、SLRSV、葡萄卷叶伴随病毒1 (grapevine leafroll-associated virus 1, GLRaV-1) 和SMYEV等病毒[7]. 巢式PCR是利用两对相互嵌套的引物进行两次扩增,即先用特异性低的引物(如简并引物)进行扩增,取少量扩增产物后再利用巢式引物进行扩增. 巢式PCR提高了检测的灵敏度,Posthuma等[39]利用巢式PCR检测SCV,解决了常规PCR不能检测弱症植株病毒的问题. 实时荧光RT-PCR,将RT-PCR和荧光技术相结合,避免了假阳性的出现,提高检测灵敏度且能实时定量检测,避免了电泳染色剂对人的毒害;周阳等[40]、高世光等[41]、苗立祥等[42]对能特异、灵敏、快速检测草莓病毒的实时荧光RT-PCR体系进行了研究. 多重PCR是在1次PCR反应中加入特殊设计的多对引物,特异性地扩增多个基因位点的反应,可以同时检测多种病毒或区分病毒的不同株系;杨洪一等[43]、常琳琳等[44]、贾慧峰[45]、史芳芳等[46]、朱海生等[47]在单一RT-PCR的基础上,对能同时检测多种草莓病毒的多重RT-PCR进行了研究.

    • 分子杂交是将少量变性的核酸固定在固体支持膜上,用专一性检测互补核酸序列的标记探针与样品进行杂交,再通过放射自显影或酶标颜色反应进行检测. 分子杂交的关键是制备特异性强、灵敏度高、具有高比活的探针,目前应用较多的是地高辛和生物素等非放射性标记探针. 由于RNA/RNA结合比DNA/RNA结合更加稳定,cRNA探针优于cDNA探针. 在用地高辛标记的探针检测SVBV时,可以在100 μg叶片中检测出SVBV[6]. 李丽丽等[48]建立了一种可快速、有效检测SMoV的体系,该体系运用了分子杂交技术,并使用了地高辛标记的cDNA探针,经试验后发现利用地高辛标记后的探针可有效检测草莓叶片中的SMoV.

    • 依赖核酸序列的扩增 (nucleic acid sequence based amplification, NASBA) 技术,也称作3SR技术 (selfsustained sequence replication),是一种快速检测病毒的新方法[6]. NASBA技术不需要PCR仪,在一般实验室内即可完成,而灵敏度高于PCR,对DNA病毒、RNA病毒和类病毒都可以检测,在检测RNA病毒时不受模板中DNA的干扰. 为了提高精度,还可以使用分子信标:当分子信标上的核苷酸与NASBA扩增产物杂交时,分子信标两条臂构象发生变化,便放出荧光;未杂交时,分子信标的两条臂结合,无荧光放出. Vašková等[49]利用NASBA结合分子信标对SVBV进行了检测,灵敏度可达到1 ng (纳克) 左右. 张志宏等[50]以宝交早生等9种草莓植株为材料,利用NASBA技术结合RT-PCR检测草莓斑驳病毒,建立起了NASBA技术检测SMoV的技术体系. 此外,NASBA技术还被用于检测SCV、SLRSV的研究中. 陈柳等[51]研究表明,RT-LAMP方法能快速、简便、特异地检测SMYEV,比RT-PCR方法检测的灵敏度高100倍,并且比RT-PCR节省时间,检测结果容易判定.

    • 病毒侵染与感病随栽培品种的栽培年限延长而增加. 由于草莓病毒的主要传播媒介—蚜虫的普遍存在,植株被病毒侵染或重复侵染的机率很高,其后代随营养繁殖而携带病毒,因而植株的感病率随之增加[52]. 病毒侵染与感病率随地理纬度的升高而增加,其主要原因是草莓病毒在高温下失去活性.

    • 草莓蚜传病毒主要通过草莓钉蚜(Chaetosiphon fragaefolii)进行传播[53-54]. 已报道的草莓蚜传病毒主要有草莓斑驳病毒、草莓轻型黄边病毒、草莓镶脉病毒和草莓皱缩病毒[55],这4种病毒一般为复合侵染,单独侵染仅会造成草莓果实减产30%左右,而复合侵染则减产可达80%[56].

    • 粉虱传播的病毒主要有草莓白化病毒(strawberry pallidosis-associated virus, SPaV)和甜菜假黄化病毒(beet pseudoyellows virus, BPYV),均属长线形病毒科(Closterviridae)毛形病毒属(Crinivirus),不能通过种子和机械传播[57]. SPaV和BPYV仅能由温室白粉虱(Trialeurodes vaporiorum)以半持久性方式传播[53],有温室白粉虱发生的地区这2种病毒广泛存在[58]. 2种病毒单独侵染常见的草莓品种时表现为无症状,但是与其它病毒复合侵染时均有明显症状出现[59].

    • 蓟马传播的病毒主要有苹果花叶病毒(apple mosaic virus, ApMV)、智利草莓潜隐病毒(Fragaria chiloensis latent virus, FClLV)和草莓坏死休克病毒(strawberry necrotic shock virus, SNSV)[53]. 3种病毒均属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus),病毒核酸为三分子线形+ssRNA,有4个ORF,分别编码2个复制酶、MP和CP,该属病毒均可以由蓟马通过取食含有病毒的花粉而进行传播[60].

    • 线虫传播的5种病毒,包括南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus, ArMV)、树莓环斑病毒(raspberry ringspot virus, RpRSV)、番茄黑环病毒(tomato black ring virus, TBRV) 和番茄环斑病毒(tomato ringspot virus, ToRSV)和SLRSV均为伴生豇豆病毒科(Secoviridae)、线虫传多面体病毒属(Nepovirus)病毒[53, 58]. 线虫传播的草莓病毒寄主范围都极为广泛,包括单、双子叶等百余种植物,溴甲烷和其它土壤熏蒸剂的使用逐渐减少了此类病毒的发生,但是一旦在田间发生将会极难控制[58].

    • 真菌传播的病毒为烟草坏死病毒 D (tobacco necrosis virus D, TNV-D),隶属于番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)坏死病毒属(Necrovirus),在自然条件下可以通过芸薹油壶菌(Olpidium brassicae)传播. TNV-D寄主范围广,能够侵染多种单、双子叶植物,自然条件下典型的侵染局限于根部[60]. 该病毒通过机械接种可以侵染烟草(Nicotiana spp.)、银苞菊(Ammobium alatum)和矮牵牛(Petunia hybrida)等多种草本植物,并能在西方烟(N. occidentalis)上系统侵染. Fránováhonetslegrová等[61]将感染TNV-D但未显症的凤梨草莓植株的叶片嫁接到指示植物野草莓上,能够产生斑驳症状.

    • 草莓青铜叶萎病毒、草莓绿瓣类菌原体、草莓丛枝类菌原体等可经叶蝉传播. 传染草莓病毒和类菌原体的叶蝉,主要有二点叶蝉、对生叶蝉和浑山叶蝉,其中二点叶蝉传毒的种类最多;叶蝉传毒有一个较长时间的循回期,如绿瓣类菌原体最短23 d[27].

    • 热处理脱毒是最早应用于培育各种营养繁殖植物无病毒母株的有效方法. 多数研究者认为:在一定的高温条件下,能使一些病毒钝化,取下在热处理期间长出的新芽进行实生嫁接,以及对土壤进行消毒,或进行组织培养,得到无病毒的原种植株. 热处理采用恒温或变温的热空气处理带病母株,其脱毒效果较好[30]. 廖俊杰等[62]将草莓栽于盆钵中置38 °C温箱中处理,发现处理15 d无脱毒效果,处理90 d脱毒率仅为66%. 不同病毒其高温处理所需时间各有不同,SMoV需38 °C恒温处理12~15 d;SMYEV和SCV需38 °C恒温处理20 d以上;SVBV的耐热性较强,热处理不易脱除[63].

    • 化学疗法就是采用病毒抑制剂抑制植物体内的病毒核酸增殖而使植物摆脱病毒获得脱病毒苗的方法,这种方法即使是采用较大的茎尖也能得到较好的脱毒效果. Fazio等于1978年报道了用病毒唑抑制番茄白枯斑病毒复制的效果,开始了用化学药剂抑制植株体内病毒的尝试;Hansan等于1985报道了将病毒唑加入培养基中培养苹果新梢顶尖,脱除了苹果褪绿叶斑病毒[64]. 廖俊杰等[65]研究指出在培养基中加入2-硫尿嘧啶后切取0.5~0.7 mm的茎尖进行培养,可以比对照提高66.8%以上的脱病毒苗率. Kondakova等[66]于1991年在培养基中加入抗病毒剂DHT(2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazine),接种并培养了3个品种的草莓茎尖,发现该试剂能有效地脱除草莓斑驳病毒和草莓皱缩病毒.

      化学试剂由于其特有的毒性,虽然能抑制病毒的复制、脱除草莓病毒,但其毒性会遗留在新生植株内,随后进入人体,有一定的安全隐患,在使用时需慎重考虑,故现在使用甚少.

    • 草莓植株在感染病毒后,其传播、扩散速度迅速,很快就能遍布全株,但病毒在各器官、组织中分布并不均匀,其中茎尖和根尖组织往往不感染或很少感染病毒. 茎尖培养脱毒的原理是1934年White[67]提出的“植物体内病毒梯度分布学说”. 1952年Morel[68]首先利用茎尖分生组织培养获得大丽菊无病毒植株,同时建立了茎尖培养脱毒的技术体系. 在草莓生产上,1962年Miller等[69]首先用茎尖培养方法脱除SMYEV、SCV和SVBV. 采用二次茎尖培养脱病毒,分化成苗率达79.2%,脱病毒率达100%. 何欢乐等[70]以丰香草莓茎尖为材料进行草莓脱毒研究,并用电镜及小叶嫁接法对脱毒苗进行鉴定,建立了丰香最适宜的脱毒方法. 高瑕虹等[71]用改良的2次重复切取茎尖的剥离方法,使茎尖剥离操作加快,茎尖分化率提高,污染降低,可全部脱除SMYEV、SMoV、SCV、SVBV. 杨波等[72]以我国自育草莓品种京藏香为试材,对草莓进行茎尖诱导萌发、继代增殖和生根培养的研究,并采用RT-PCR对其带病毒情况检测并对脱毒效果进行评价. 钱长根等[73]就传统草莓茎尖脱毒技术所存在的问题进行了研究,摸索出了一套草莓根尖脱病毒组培快繁及规模化生产技术,该方法具有操作简便、效率高、消毒易彻底、组培苗污染率低、繁殖速度快等优点.

    • 用高温处理植株,所用的时间长、植株易枯死且脱毒率不高;而用茎尖培养需在解剖镜下切取很短的茎尖,操作、培养都很困难且脱毒率低. 如果把热处理和茎尖培养结合起来,则茎尖可适当取长,培养也容易,对于某些需要高温才能脱除的病毒(SVBV、SCV)也可以脱去. 热处理与茎尖培养相结合脱病毒的方法中,效果较好且易于操作的方式有3种:第1种为先热处理,而后取在处理中长出的新茎尖进行组织培养. 据王际轩[74]报道,该种脱病毒法的脱病毒率可达80.6%~100%. 第2种为先茎尖培养,再热处理,据报道,该种处理方法其脱病毒率可达72.7%~100%[64]. 第3种为先水浴热处理再茎尖培养. 刘健[75]以丰香为材料,建立了丰香热处理结合茎尖脱毒的繁育体系. 李志强等[2]以草莓品种“红颜”、“章姬”为试材,采用茎尖培养与热处理方法获得草莓脱毒组培苗,并建立其组培快繁体系. 顾地周等[76]以深山草莓变异新品种“长白1号”为材料,用高温处理结合茎尖培养对该品种进行脱毒研究,结果表明该方法可以完全脱除草莓病毒,建立了该草莓品种的脱毒体系. 陈怀勐等[77]以红颜为材料,采用热处理结合茎尖脱毒的方法对红颜进行脱毒,大面积种植结果表明该脱毒苗产量可达3 500 kg. 赵海红[78]以童子一号草莓茎尖为外植体,采用热处理和二次茎尖培养相结合的方法脱除病毒,发现该种方法脱毒效果明显,成苗率高达60.33%,平均脱毒率达到80.58%.

    • 1974年大泽胜次通过花药培养获得再生植株,经鉴定证明:再生植株为脱毒植株,脱毒率为100%;宫崎正则等对草莓花药培养的脱毒率进行了研究,品种“America”的脱毒率达50%~81%,而品种“Empire”的脱毒率则达到100%[79]. 在我国,覃兰英等[80]最早利用花药愈伤组织诱导再生植株的方法,培育了“春香”、“宝交早生”、“达娜”等品种的花药脱毒苗. 陈玉波等[79]用指示植物对“沙尔普斯”、“红岗利德”、“宝交早生”、“春香”、“索非亚”等5个品种的花药培养植株进行了病毒鉴定,结果表明组培苗不带SMYEV、SVBV、SCV、SMoV等 4种主要病毒,即为无病毒植株. 晁慧娟等[81]以甜查理为材料,用花药培养方式对其花蕾进行脱毒;而赵永钦等[82]以甜查理和章姬为材料,对其花蕾脱毒,建立了草莓花药培养高频诱导体系并获得了单倍体植株.

    • 超低温脱毒是近年来兴起的一种新的脱毒方法. 其原理为:含有病毒的顶端细胞的液泡较大,胞液中含有的水分也较多,在超低温保存过程中易被形成的冰晶破坏致死,而增殖速度较快的分生组织含的水分少、胞质浓、抗冻性强,不宜被冻死[83]. 液氮的超低温能杀死含较大液泡的细胞,而保存液泡小的顶端分生组织细胞,分生组织中一般是无病毒的,因此,再生植株是无病毒的[84]. 自1997年Brison等首次用超低温保存结合茎尖离体培养,成功的去除了李属根状茎上的李豆病毒,其脱毒率达到50%后,便开创了超低温脱毒的方法[84]. 茎尖超低温脱毒被认为是脱除植物病毒最有效的方法,为脱毒苗生产开辟了一条崭新的途径. 截至目前,该技术已成功地用于脱除包括甘薯[85]、柑橘[86]、李[84]、葡萄[87]、香蕉[88]等植物在内的多种病原体,如病毒、支原体和细菌. 蔡斌华等[89]以栽培种明宝为材料,利用玻璃化超低温技术对SMYEV进行脱除,发现该技术能简便有效地脱除 SMYEV. 周世杰[90]以丰香等3个草莓品种为材料,用超低温方式处理草莓茎尖以脱除几种草莓常见病毒(SCV, SMoV, SMYEV, SVBV),并对所得组培草莓苗进行了检测. 盛宏亚等[91]以携带草莓斑驳病毒的红颜草莓为材料,通过对玻璃化超低温脱毒技术进行优化,建立了适合红颜茎尖玻璃化超低温脱毒体系. 罗娅等[92]以感染SCV、SMoV、SMYEV和SVBV的红颜草莓茎尖为试材,对超低温脱毒体系进行优化,建立了完善的草莓超低温疗法脱毒技术体系. 邱静[93]以红颜(Fragaria × ananassa Duch. cv. Benihoppe)为材料,建立起了完善的超低温疗法脱毒技术体系,并在此基础上,研究了多重RT-PCR病毒检测体系,建立起完善的多重RT-PCR病毒检测体系.

      同传统的茎尖培养脱毒方法相比,超低温脱毒技术对茎尖大小的要求不严格,这不仅克服了茎尖剥离带来的技术难题,而且解决了茎尖大小与成活率和脱毒率之间的矛盾.

    • 培育无病毒母本苗、栽培无病毒苗木,是防治草莓病毒病的根本对策. 经过脱毒后,脱毒苗较普通苗具有以下优势:苗整齐一致、生长健壮、根系发达、叶色浓绿、叶片增大;大田繁苗数量显著增加;果实成熟快,相对提早上市;果数及果重明显增加,产量可提高50%以上;抗病及抗冻性明显增强[30]. 在进行草莓品种引进时,一定要严格引进脱毒苗,严防带病毒苗对草莓种植带来损失.

    • 在草莓种植前,对土壤进行消毒. 翻耕土壤后撒入石灰(用量为750 kg·hm−2(50 kg/亩)),烈日下晒7~10 d,然后作畦,并用氯化苦(用量为300 kg·hm−2(20 kg/亩)药液)或溴甲烷等进行土壤消毒,施药后即行畦面覆膜;对于发病的地块:栽前每亩用65%可湿性代森铵1 kg,掺细土15 kg进行沟或穴施. 要充分利用夏季高温闲茬时期,在施肥翻地后盖严塑料薄膜,关好大棚门和放风口,闷棚5~15 d,使棚温尽可能高,可有效预防根腐病、黄萎病、枯萎病等土传病害发生,同时高温也可以杀死线虫及其他虫卵[94].

      在草莓生长期内保持草莓园内整洁、干净,及时清除草莓地的枯枝落叶及田边杂草,棚内注意通风换气,减少湿度和废气;采用深沟向畦栽培,四周开好排水沟,降低地下水位. 用地膜覆盖或地面铺草以提高地温,增施有机肥料、合理施用化肥,以促进草莓健壮生长,提高抗病力;及时拔除病株、摘除病叶并进行销毁等,对防止或减轻发病均有一定的效果.

      近几年发展起来的无土栽培技术,不再用天然土壤而用基质或仅育苗时用基质,在定植以后用营养液进行灌溉的栽培方法. 该方法可有效防止土壤连作病害及土壤盐分积累造成的生理障碍,具有省水、省肥、省工、高产优质等特点,可考虑用于草莓种植,在减少土传病害发生的同时能提高土地的利用效率.

    • 蚜虫是草莓病毒病的重要传播载体,应注意对蚜虫的防治. 应用蚜虫的趋避性设置防蚜黄板诱蚜、银灰膜避蚜,能起到较好的防治效果[94]. 秋季要适当晚栽,避开蚜虫飞迁期;另外,在育苗时要及时灭蚜、灭虱、灭蓟马. 加强设施草莓棚室的防虫网配置是最有效阻断害虫传毒的措施. 草莓苗移栽前2~3 d,用25%的阿克泰水分散颗粒剂1 500~2 000倍液喷淋幼苗,药液要渗透到土壤中;每平方米苗床喷药液2 kg左右,对防治蚜虫和防治病毒病的效果很好[94]. 同时对叶蝉等其他草莓病毒病传播媒介也要防治,用黄板、糖醋液等对其进行诱杀.

      利用转基因技术把抗蚜虫基因导入草莓,培育抗蚜新品种,是综合防治草莓蚜虫的理想手段[95]. James等[96]于1992年首先开展了草莓抗虫转基因研究,他们将与几种鳞翅目和鞘翅目害虫抗性有关的CpTi基因转入草莓品种“Raoelh”中,获得了转基因植株. 抗性品种的长期栽培会导致其抗虫性水平下降,预测靶标害虫会在一定时期内对转基因植物产生抗性,将2种或2种以上不同的抗蚜基因转入草莓可获得同时表达多种抗蚜基因的植株,这样有望增加抗蚜谱和延缓蚜虫抗性的产生. 转基因草莓品种Pavana是转入3个抗草莓疫霉菌病害基因后育成的新品种,其抗性基因分别为Rpf1Rpf3Rpf6,其植株对草莓疫霉菌病害抗性效果十分明显,并且也增强对其他病害的抵抗力[95]. 马俊岭等[97]用高效液相色谱法测定了用来防治草莓蚜虫的啶虫脒在蚜虫体内的残留动态,并对草莓中残留的啶虫脒可能对膳食产生的风险进行了评估,发现喷施3%啶虫脒乳油防治草莓蚜虫,对人群膳食产生风险较小,可用作草莓生产中防治蚜虫安全性较好的杀虫剂.

    • 用嘧呔酶素300倍液治根或定植时浇根,用消毒分1 000倍液栽植或苗期喷雾;在掐匍匐茎或摘病叶后,要及时喷2种防病毒药[94]. 用25%的阿克泰水分散颗粒剂2 500~5 000倍液、10%吡虫啉可湿性粉剂1 000倍液、10%的抗虱丁可湿性粉剂1 000倍液、2.5%绿色功夫水剂1 500倍液、1.5%的植病灵乳油1 000倍液、30%病毒星可湿性粉剂500倍液进行喷施,对于草莓病毒病都有一定的控制作用[98].

    • 草莓的品种不同,其对病毒病的抗病性也不一样. 在栽培时,为了减少病毒病的发生或者减缓危害,应选用对病毒病抗性较强的品种进行栽培,如红颜、美国3号、女峰、大赛、竟香等品种[98]. 草莓无病毒幼苗在生产过程中,还会发生再感染,一般在新建种植区周围2 km以内无老草莓园时,应2~3年换1次种;周围有老园或处于重病区时,最好考虑每年一换.

    • 栽培草莓由于其特有的繁殖方式,在栽培过程中导致病毒在植株体内不断积累,加之草莓病毒具有种类繁多、侵染途径多样、侵染方式复杂等特征,在草莓种植过程中为病害防治带来诸多不便. 在草莓病毒病防治过程中,多以高效、低毒新型药剂为主,而这与当前可持续发展的主题有所冲突,今后可加大对草莓病毒病生物防治方面的研究工作. 同时,建立健全的种苗繁育体系,从源头上管控草莓病毒,引进已脱毒成功的草莓品种,积极动员科研人员对草莓相关病毒的研究,大力推广脱毒草莓苗的种植,对脱毒草莓种质进行规范化保藏.

      国内外学者对草莓病毒的常见传播媒介如蚜虫[54]、粉虱[53]、线虫[53]、真菌[60]等进行了研究,为生产中草莓病毒病的防治提供了理论依据,而对其他潜在的诸如地表径流、风等传播媒介能否传播草莓病毒、对草莓病毒的传播有何影响等方面鲜有报道. Tzanetakis等[53]于2013年对北美地区草莓病毒的传播媒介进行了研究,其中提及了花粉可作为草莓病毒的传播媒介,而国内对花粉传病毒方面的研究还处于空白状态,研究人员可从此处入手,在填补国内研究空缺的同时还可以扩充草莓病毒的传播媒介,为草莓病毒的防治提供更多的思路.

      随着分子生物学的发展,以核酸为研究对象的先进的分子生物学检测方法在草莓病毒的检测上得到应用,其所具有的灵敏度高、特异性强、适应范围广、不受检测时间的限制和操作简便快速等优势,均是传统检测方法无法比拟的. 基因芯片技术是DNA杂交技术与荧光标记技术相结合的基因水平检测方法,具有灵敏度高和可靠性强的特点[99],马新颖等[100]、贾慧等[101]用基因芯片对黄瓜花叶病毒等病毒进行检测,结果表明基因芯片能快速、准确的检测出植物病毒. Eichmeier等[102]采用二代测序技术(next-generation sequencing technology,NGS)对捷克境内葡萄中的病毒和类病毒进行了全谱检测,能快速和详尽的了解植物组织中病毒和类病毒的信息;Akinyemi[103]以烟草、玉米和草莓叶片为材料,综合应用二代测序技术、生物信息学和分子生物学等技术对植物中潜在的病毒进行快速、准确地发现和鉴定;Roossinck等[104]、Stobbe等[105]用病毒宏基因组学(virus/viral metagenomics)技术对植物病毒进行了研究,为揭示植物与病毒的互作提供了新途径. 将二代测序技术、宏基因组学、单细胞测序(single cell sequencing,SCS)等技术运用于草莓病毒的研究,在基因水平探究宿主植物与病毒的关系,为防治病毒提供科学的依据.

      综上所述,通过对检测方法的改进及革新,建立起草莓病毒标准化的检测体系,运用新技术以提高检测的准确性和可重复性,简化检测步骤及降低成本,这是未来的趋势. 为了缓解草莓种植过程中病毒的浸染及积累对草莓产业发展的制约,综合防治草莓病毒势在必行,即选育抗病毒草莓品种、运用脱毒苗、加强田间管理、阻断病毒传播媒介、品种轮换及化学药剂的合理使用等多种措施进行防治.

参考文献 (105)

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