AP121在大鼠体内的组织分布研究

崔佳丽 闫倩倩 赵高琼 张培培 苏敏 王京昆 刘红斌

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AP121在大鼠体内的组织分布研究

    作者简介: 崔佳丽(1987−),女,吉林人,副主任药师. 主要研究方向为药物代谢、药物安全性评价研究. E-mail:cuijiali19870626@126.com;
    通讯作者: 刘红斌, 3424045368@qq.com
  • 中图分类号: R917;R969; R971.43

Study on tissue distribution of AP121 in rats

    Corresponding author: LIU Hong-bin, 3424045368@qq.com
  • CLC number: R917;R969; R971.43

  • 摘要: 本研究试图建立抗抑郁新药AP121在大鼠体内主要脏器组织的药物浓度检测方法,并研究其在大鼠体内的分布规律. 选用健康SPF级SD大鼠24只,随机分为A、B、C三组,每组8只,雌雄各半,每组中随机选择1只大鼠作为空白对照(0 h),其他7只按19.32 mg·kg−1给予AP121 Labrasol溶液后于1、4、9 h采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织样本,采用HPLC-MS/MS法检测5种脏器组织中AP121的浓度. 结果显示,1、4、9 h 3个时间点5种组织中的AP121浓度分布分别为:肝脏>肺脏>心脏>脾脏>肾脏、肺脏>肝脏>心脏>脾脏>肾脏、肝脏>肺脏>心脏>脾脏>肾脏;AP121肺脏、心脏及肝脏中浓度个体差异大;肝脏中的AP121在1 h达最高浓度,其它4种脏器组织中AP121均在4 h达最高浓度,9 h各组织中的浓度大幅下降、且低于1 h. 分析结果表明,本研究所建立的LC-MS/MS法测定大鼠5种主要脏器中AP121的分析检测灵敏、准确、可靠,可为该药系统的药代动力学评价提供技术支持;肝脏和肺脏可能是AP121的代谢转化器官或作用的靶器官,后续药物开发过程中,需关注药物对肺脏、心脏及肝脏的个体影响差异,且需重点关注药物对于肝脏和肺脏的影响.
  • 图 1  AP121(1-a)和内标DPI289(1-b)结构式

    Figure 1.  The chemical structures of AP121 and DPI289

    图 2  肺脏组织特异性

    Figure 2.  Specificity chromatogram of lung

    图 3  大鼠五种脏器组织中不同时间点的AP121质量浓度(n=7,$\bar x$±s

    Figure 3.  Tissue concentration-time curves of AP121 at 1, 4, 9 h (n=7,$\bar x$±s)

    图 4  AP121 在大鼠五种脏器组织中不同时间点的分布图(n=7,$\bar x$±s

    Figure 4.  Tissue concentrations of AP121 at 1, 4, 9 h (n=7,$\bar x$±s)

    表 1  各组织匀浆中AP121线性回归方程

    Table 1.  Calibration curve of AP121 concentrations in tissues

    组织回归方程相关系数
    心脏Y=1.79×10−2 X+0.0502×10−20.9964
    肝脏Y=1.87×10−2 X+0.0485×10−20.9983
    脾脏Y=1.89×10−2 X+0.275×10−20.9966
    肺脏Y=1.74×10−2 X−0.174×10−20.9984
    肾脏Y=1.74×10−2 X+0.208×10−20.9978
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    表 2  给药后大鼠对应组织样本的测定结果(n=7,$\bar x$±s

    Table 2.  Tissue concentrations of AP121 after administration(n=7,$\bar x$±s(ng·mL−1)

    名称组别t/hNo.1No.2No.3No.4No.5No.6No.7No.8$\bar x$±sRSD/%
    心脏 A 1 147.4 150.6 56.72 124.4 128.4 146.8 146.2 - 128.6±33.3 25.89
    B 4 99.57 607.3 294.5 203.1 104.8 138.6 251.0 - 242.7±176.8 72.85
    C 9 44.63 50.81 65.24 70.26 50.42 55.46 36.66 - 53.35±11.56 21.67
    肝脏 A 1 1345 1123 745.0 1552 638.4 670.9 479.8 - 936.3±405.2 43.28
    B 4 869.5 1523 1200 813.7 187.1 277.9 593.4 - 780.7±478.9 61.34
    C 9 93.73 90.78 128.7 196.7 51.78 28.11 21.12 - 87.27±61.75 70.76
    脾脏 A 1 79.89 103.2 44.26 110.8 112.3 112.5 93.47 - 93.77±24.89 26.54
    B 4 88.50 283.2 181.8 217.1 85.63 80.26 191.9 - 156.1±84.6 54.20
    C 9 34.93 31.29 48.57 50.30 31.06 28.00 24.25 - 35.49±10.09 28.43
    肺脏 A 1 199.1 268.6 142.6 2407 192.1 239.3 228.1 - 525.3±830.7 158.14
    B 4 242.9 1267 569.6 394.1 161.8 309.5 3611 - 936.6±1236 131.97
    C 9 67.62 67.69 87.35 73.72 66.86 81.09 48.99 - 70.47±12.24 17.37
    肾脏 A 1 80.88 88.31 34.27 88.40 80.90 86.32 89.26 - 78.33±19.74 25.20
    B 4 56.44 152.7 88.91 105.4 44.20 38.50 76.77 - 80.42±39.95 49.68
    C 9 22.21 19.87 24.18 26.45 18.87 19.73 16.20 - 21.07±3.46 16.42
    No.8为A、B、C组空白对照大鼠的组织样本
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-07-11
  • 录用日期:  2020-03-15
  • 网络出版日期:  2020-06-11

AP121在大鼠体内的组织分布研究

    作者简介:崔佳丽(1987−),女,吉林人,副主任药师. 主要研究方向为药物代谢、药物安全性评价研究. E-mail:cuijiali19870626@126.com
    通讯作者: 刘红斌, 3424045368@qq.com
  • 1. 云南省药物研究所,云南 昆明 650111
  • 2. 云南白药集团创新研发中心,云南 昆明 650111
  • 3. 云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室,云南 昆明 650111

摘要: 本研究试图建立抗抑郁新药AP121在大鼠体内主要脏器组织的药物浓度检测方法,并研究其在大鼠体内的分布规律. 选用健康SPF级SD大鼠24只,随机分为A、B、C三组,每组8只,雌雄各半,每组中随机选择1只大鼠作为空白对照(0 h),其他7只按19.32 mg·kg−1给予AP121 Labrasol溶液后于1、4、9 h采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织样本,采用HPLC-MS/MS法检测5种脏器组织中AP121的浓度. 结果显示,1、4、9 h 3个时间点5种组织中的AP121浓度分布分别为:肝脏>肺脏>心脏>脾脏>肾脏、肺脏>肝脏>心脏>脾脏>肾脏、肝脏>肺脏>心脏>脾脏>肾脏;AP121肺脏、心脏及肝脏中浓度个体差异大;肝脏中的AP121在1 h达最高浓度,其它4种脏器组织中AP121均在4 h达最高浓度,9 h各组织中的浓度大幅下降、且低于1 h. 分析结果表明,本研究所建立的LC-MS/MS法测定大鼠5种主要脏器中AP121的分析检测灵敏、准确、可靠,可为该药系统的药代动力学评价提供技术支持;肝脏和肺脏可能是AP121的代谢转化器官或作用的靶器官,后续药物开发过程中,需关注药物对肺脏、心脏及肝脏的个体影响差异,且需重点关注药物对于肝脏和肺脏的影响.

English Abstract

  • 抑郁症是一种发病率极高的情感性精神障碍,影响高达14%的人口,其影响力可持续终身[1-2],并且在个人和社会层面造成巨大负担[3]. 抑郁症发病机制多被认为与受体功能降低和单胺能神经递质含量减少密切相关,另有人提出抑郁症与内分泌系统、循环系统、遗传因素以及社会心理因素有关. 现有明确疗效的抗抑郁药物基本均作用于神经末梢突触部位[4-5]. 目前,市场常见抗抑郁临床用药有阿米替林、氟伏沙明、色曲林等,但均具有诸如胃肠道反应、失眠嗜睡等副作用,且易出现耐药性[4]. 本研究开发的全新结构的三芳基二甲基哌嗪化合物AP121为δ-受体激动剂,AP121[AP121(1-a)和内标DPI289(1-b)]结构式见图1[6]. 该化合物用于治疗抑郁症基于阿片受体理论,由阿片受体亚型δ-受体介导的激动剂具有较强的抗抑郁、抗焦虑作用,并且可缓解呼吸抑制、胃肠道反应等症状,可极大地降低身体依赖性[7-9],故δ-受体激动剂具有极大的抗抑郁药物研发潜能[7, 10-11]. AP121选择性作用于抗抑郁活性δ-受体特定位置,可降低δ-受体代谢并明显提高δ-受体活性[9]. 另外,其结构对于δ-受体具有很强的亲核性,故起效速度快[612]. 有研究表明与AP121结构相近的δ-受体激动剂SNC80和(+)BW373U86单次给药后抗抑郁效果明显[13]. 该药尚在临床前研发阶段,前期研究表明[14-16],AP121具有明确的抗抑郁作用,并且在短期内不出现耐受性,合成工艺稳定,具有良好的抗抑郁新药开发前景. 本文通过对AP121口服给药后在大鼠5种主要组织器官的分布规律进行研究评价,可为该药系统的药代动力学评价提供技术支持,为AP121的药效和毒理学机制研究提供科学依据.

    图  1  AP121(1-a)和内标DPI289(1-b)结构式

    Figure 1.  The chemical structures of AP121 and DPI289

    • Agilent 1200SL-API 3200 Q-Trap液相色谱-三重四级杆质谱仪(美国Agilent、AB公司),Analyte 1.5质谱工作站;DV215CD电子天平(美国OHAUS公司);Allegra 64R高速冷冻台式离心机(美国Backman公司);XW-80A旋涡混合器(上海精科实业有限公司);MD 200氮气吹扫仪(杭州奥盛仪器有限公司);FSH-2A可调高速匀浆机(常州市金坛友联仪器研究所);ELIXTM+Milli-Qsynthesis超纯水机(美国Millipore公司).

      AP121 labrasol溶液(质量浓度24.15 mg·mL−1,批号20140620),AP121(纯度>99%,相对分子质量为529.69,批号为CBQ02146-131015);内标DPI289(纯度>96%,相对分子质量为503.65,批号为ZZ-090408);均由云南省药物研究所项目管理部提供. 甲醇(色谱纯,美国Merck公司)、甲酸(色谱纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),乙酸乙酯、二氯甲烷(分析纯,广州光华科技股份有限公司).

    • 24只SPF级SD大鼠,7~8周龄,雌雄各半,210±30 g,北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物生产许可证号:SCXK(京)2012-0001,研究已通过实验动物福利伦理委员会(IACUC)审查合格.

    • 前期药代研究结果表明,大鼠灌胃给予AP121 Labrasol溶液后,约在3~4 h达血药浓度峰值,故选择给药后1、4、9 h这3个时间点分别代表吸收相、平衡相和消除相的药物分布. 上述动物适应性饲养后按前述3个时间点分为A、B、C三组,每组8只(雌雄各半),动物禁食不禁水约12 h后,每组中第8只大鼠用作空白对照(0 h),其他7只按19.32 mg/kg.bw给药1次.

    • 每组除空白对照大鼠外,A、B、C组大鼠分别于在给药后1、4、9 h,乙醚麻醉,放血至净,解剖,取心、肝、脾、肺、肾五种脏器. 应用冰生理盐水将脏器血液冲洗至净,滤纸吸尽水分,精确称重后置于蒸发皿中,剪至肉糜状,按脏器重量:生理盐水体积=1:3量加入生理盐水,匀浆机1.20万r·min−1,匀浆3~4次,30 s/次,至均一状. 将匀浆好组织样本100 uL/管分装,−20 ℃冻存. 上述操作于冰浴下进行.

    •   (1)对照品溶液的制备 取AP121标准品适量于容量瓶中,精密称定,加甲醇溶解后定容至刻度,摇匀,即得质量浓度约为0.2 mg·mL−1的AP121储备液,4 ℃保存. 该储备液在2~8 ℃冷藏可稳定保存2个月. 将此储备液稀释成相应浓度的对照品工作液,内标DPI289工作液浓度为484.3 ng·mL−1.

      (2)样品预处理 取100 µL匀浆好的组织样品,精密加入内标工作液10 µL,涡旋混匀,精密加入1%甲酸溶液200 µL,旋涡1 min,再加入1 mL二氯甲烷. 旋涡至完全乳化后再旋涡1 min,53 KHz超声3 min,6000 r·min−1离心10 min,取出二氯甲烷层200 µL,室温氮吹至干,残渣加流动相200 µL复溶,15000 r·min−1离心10 min,取上清液至进样瓶中,备用.

      (3)色谱条件 Agilent ponoshell EC-C18色谱柱(2.7 µm,50 mm×4.6 mm);流动相为甲醇−0.1%甲酸溶液=70︰30;流速0.5 mL·min−1;柱温30 ℃;进样量5 µL.

      (4)质谱条件 质谱电喷雾离子化(ESI),正离子模式. 多反应监测(MRM)定量:AP121 [M+H]+m/z:530.3,定量/定性碎片离子,m/z=308.2/209.1;DPI289 [M+H]+m/z:504.3,定量/定性碎片离子,m/z=282.2/209.1. 离子源参数为:气帘气(CUR):25.00 psi,喷雾电压(IS):4600.00 V,雾化温度(TEM):600.00 ℃,雾化器(GS1):55.00 psi,辅助气(GS2):60.00 psi,碰撞气(CAD):Low. 质谱检测电压分别为:AP121,去簇电压(DP):50.00/50.00 V,射入电压(EP):3.50/3.50 V,碰撞池入口电压(CEP):25.00/25.00 V,碎裂电压(CE):27.00/49.00 V,碰撞室射出电压(CXP):4.50/3.60 V;DPI289,DP:50.00/50.00 V,EP:3.50/3.50 V,CEP:25.00/25.00 V,CE:27.00/49.00 V,CXP:4.00/3.80 V.

    • 所有试验数据均应用SPSS 19.0版软件进行数据处理,以Mean±SD表示.

    • 本试验所建立的LC-MS/MS条件下,AP121及内标DPI289在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织中特异性良好,无明显干扰峰,AP121及内标DPI289保留时间分别为1.28、1.67 min. 以肺脏组织为代表的特异性考察结果见图2.

      图  2  肺脏组织特异性

      Figure 2.  Specificity chromatogram of lung

    • 分别取大鼠空白心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏匀浆,加入AP121标准溶液,使各组织匀浆样本中AP121的质量浓度分别为0.9951、3.980、15.92、63.69、254.8、1019 ng·mL−1. 以AP121峰面积和内标峰面积比值为纵坐标Y,AP121质量浓度为横坐标X进行线性回归,获得AP121于各组织脏器中的回归方程及相关系数见表1,结果表明,AP121于各组织脏器中在0.9951~1 019 ng·ml−1范围内线性关系良好.

      组织回归方程相关系数
      心脏Y=1.79×10−2 X+0.0502×10−20.9964
      肝脏Y=1.87×10−2 X+0.0485×10−20.9983
      脾脏Y=1.89×10−2 X+0.275×10−20.9966
      肺脏Y=1.74×10−2 X−0.174×10−20.9984
      肾脏Y=1.74×10−2 X+0.208×10−20.9978

      表 1  各组织匀浆中AP121线性回归方程

      Table 1.  Calibration curve of AP121 concentrations in tissues

    • 日内、日间精密度与准确度结果表明和AP121质控样本在大鼠各组织匀浆中的日内精密度RSD%值为0.51%~13.72%,准确度在100.38%~113.25%范围内,日间精密度RSD%值为3.49%~13.22%,准确度在99.61%~107.83%范围内,满足生物样品定量分析要求.

    • 处理低、中、高3个浓度的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织质控样品,每浓度6份. 与对应浓度标准溶液比较,计算提取回收率,3个浓度各组织质控样品的平均提取回收率分别为:心脏101.41%±2.10%,肝脏96.32%±7.88%,脾脏99.40%±8.43%,肺脏97.96%±3.93%,肾脏93.88%±2.49%;相对标准偏差RSD%分别为:心脏2.07%,肝脏8.18%,脾脏8.48%,肺脏4.01%,肾脏2.65%. 结果表明,该方法的提取回收率均较高,回收率对不同浓度AP121分析检测的影响一致,符合生物样本分析检测要求.

    • 处理低、中、高3个浓度的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织质控基质样品,每浓度6份. 与对应浓度标准溶液比较,计算归一化基质效应. 3个浓度各组织质控样品的平均归一化基质效应分别为:心脏98.91%±6.22%,肝脏104.23%±5.43%,脾脏102.62%±7.51%,肺脏105.55%±8.41%,肾脏104.98%±0.64%;相对标准偏差RSD分别为:心脏6.29%,肝脏5.21%,脾脏7.32%,肺脏7.97%,肾脏0.61%. 结果表明,基质效应对不同浓度AP121分析检测的影响一致,符合生物样本分析检测要求.

    • 稳定性考察结果显示,处理后心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏5种组织质控样品于室温放置24 h、2~8 ℃存放48 h后,测定浓度的相对标准偏差RSD为1.54%~8.17%,测定浓度和理论浓度的相对偏差RE为−11.02%~13.54%. 未处理组织质控样品稳定性考察,5种组织质控样品于2~8 ℃存放1 d、−20 ℃存放5 d后,测定浓度的相对标准偏差RSD为1.64%~6.01%,测定浓度和理论浓度的相对偏差RE为−12.47%~4.29%. 这些结果表明AP121在所考察的条件下稳定,符合生物样品测定要求.

    • 大鼠灌胃给予AP121 Labrasol溶液19.32 mg·kg−1,药物组织分布结果见表2图3图4.

      名称组别t/hNo.1No.2No.3No.4No.5No.6No.7No.8$\bar x$±sRSD/%
      心脏 A 1 147.4 150.6 56.72 124.4 128.4 146.8 146.2 - 128.6±33.3 25.89
      B 4 99.57 607.3 294.5 203.1 104.8 138.6 251.0 - 242.7±176.8 72.85
      C 9 44.63 50.81 65.24 70.26 50.42 55.46 36.66 - 53.35±11.56 21.67
      肝脏 A 1 1345 1123 745.0 1552 638.4 670.9 479.8 - 936.3±405.2 43.28
      B 4 869.5 1523 1200 813.7 187.1 277.9 593.4 - 780.7±478.9 61.34
      C 9 93.73 90.78 128.7 196.7 51.78 28.11 21.12 - 87.27±61.75 70.76
      脾脏 A 1 79.89 103.2 44.26 110.8 112.3 112.5 93.47 - 93.77±24.89 26.54
      B 4 88.50 283.2 181.8 217.1 85.63 80.26 191.9 - 156.1±84.6 54.20
      C 9 34.93 31.29 48.57 50.30 31.06 28.00 24.25 - 35.49±10.09 28.43
      肺脏 A 1 199.1 268.6 142.6 2407 192.1 239.3 228.1 - 525.3±830.7 158.14
      B 4 242.9 1267 569.6 394.1 161.8 309.5 3611 - 936.6±1236 131.97
      C 9 67.62 67.69 87.35 73.72 66.86 81.09 48.99 - 70.47±12.24 17.37
      肾脏 A 1 80.88 88.31 34.27 88.40 80.90 86.32 89.26 - 78.33±19.74 25.20
      B 4 56.44 152.7 88.91 105.4 44.20 38.50 76.77 - 80.42±39.95 49.68
      C 9 22.21 19.87 24.18 26.45 18.87 19.73 16.20 - 21.07±3.46 16.42
      No.8为A、B、C组空白对照大鼠的组织样本

      表 2  给药后大鼠对应组织样本的测定结果(n=7,$\bar x$±s

      Table 2.  Tissue concentrations of AP121 after administration(n=7,$\bar x$±s(ng·mL−1)

      图  3  大鼠五种脏器组织中不同时间点的AP121质量浓度(n=7,$\bar x$±s

      Figure 3.  Tissue concentration-time curves of AP121 at 1, 4, 9 h (n=7,$\bar x$±s)

      图  4  AP121 在大鼠五种脏器组织中不同时间点的分布图(n=7,$\bar x$±s

      Figure 4.  Tissue concentrations of AP121 at 1, 4, 9 h (n=7,$\bar x$±s)

      各时间点分组(A、B、C)的空白大鼠5种脏器组织在3个时间点均未检测出AP121. 说明在实验过程中均未产生干扰或污染. 在1、4 h时间点,AP121肺脏中浓度个体差异大;在4 h时间点,AP121心脏中浓度个体差异大;在4、9 h时间点,AP121肝脏中浓度个体差异大. 在1 h时间点,AP121在组织中的浓度分布情况为:肝脏>肺脏>心脏>脾脏>肾脏;在4 h时间点,AP121在组织中的浓度分布情况为:肺脏>肝脏>心脏>脾脏>肾脏;在9 h时间点,AP121在组织中的浓度分布情况为:肝脏>肺脏>心脏>脾脏>肾脏. 除肝脏中AP121浓度在第一个时间点即达较高的浓度值外,其他4种脏器组织中AP121浓度在4 h达分布峰值,浓度先升高后降低,于9 h时各脏器组织中的AP121浓度大幅下降、且均低于1 h时的浓度值,各脏器中1 h浓度值分别为9 h浓度值的2.41~10.73倍. 且除肝脏外4种脏器组织中的分布变化与前期药代动力学研究中血药浓度变化趋势一致.

    • AP121可降低δ-受体代谢并明显提高δ-受体活性,是全新结构的抗抑郁化合物. 该药尚在临床前研发阶段,因此,其药物代谢相关研究并无文献资料借鉴参考. 本文建立了液相色谱-质谱法测定大鼠五种主要脏器中AP121的分析检测方法,并对其口服给药后在大鼠五种主要组织器官的分布规律进行研究评价,所建立方法灵敏、准确、可靠,可为该药系统的药代动力学评价提供技术支持,组织分布评价可为AP121的药效和毒理学机制研究提供科学依据[18].

      研究结果提示,在本实验设计条件下,除肝脏外其它4种脏器组织的AP121浓度在4 h达分布峰值,随后组织中的AP121浓度下降,其中,以肺脏中AP121浓度下降最快. 约4 h时AP121进入大鼠体内分布阶段,肺脏、心脏、脾脏、肾脏中浓度分布升高,其中肺脏中药物浓度高于肝脏及其它脏器中的浓度. 肝脏中于1 h即达峰值,前期研究结果表明,此时AP121血药浓度研究结果表明尚处于吸收相,随后快速下降,这可能与肝脏是药物代谢的主要脏器有关[19],药物代谢转化的具体情况有待进一步研究. 任一时间点大鼠肝脏、肺脏中的AP121浓度均远高于其他3种组织,提示肝脏和肺脏可能是AP121的代谢转化器官或作用的靶器官;AP121浓度在考察时间点于肺脏、心脏及肝脏中浓度个体差异大,提示后续药物开发过程中,需关注药物对肺脏、心脏及肝脏的个体影响差异,且需重点关注药物对于肝脏和肺脏的影响. AP121于9 h时各脏器组织中的AP121浓度均大幅下降、且均低于1 h时的浓度值,各脏器中1 h浓度值分别为9 h浓度值的2.41~10.73倍. AP121为难溶性药物,溶解性是药物吸收限速关键因素,制剂研究尝试过不同的助溶剂,筛选后确定labrasol作为制剂辅料,该辅料为难溶性药物常用表面活性剂,具有较好的助溶效果,且在体内具有促渗效果,可以提高AP121经口途径的绝对生物利用度. 另外,研究表明,一定浓度的labrasol在回肠和结肠中能够有效地抑制P-gp功能[20],故于AP121 labrasol制剂后续研发过程中应对可能出现的药物药物相互作用进行进一步研究. AP121选择作用于抗抑郁活性δ-受体特定位置,在精神活动方面发挥作用[9-10],并且在短期内不出现耐受性,其在治疗抑郁症方面有发挥作用较快的潜力,具有较好研发前景.

参考文献 (20)

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