黄毛草莓愈伤组织诱导条件优化

代雄伟 瞿鹏 刁霞 唐云刚 陶磅 乔琴

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黄毛草莓愈伤组织诱导条件优化

    作者简介: 代雄伟(1995−)男,云南人,硕士生,研究方向为草莓种质资源收集;
    通讯作者: 陶磅, taopang@sina.com ; 乔琴, qiaoqin@ynu.edu.cn
  • 中图分类号: S324

Callus induction of Fragaria nilgerrensis

    Corresponding author: TAO Pang, taopang@sina.com ;QIAO Qin, qiaoqin@ynu.edu.cn
  • CLC number: S324

  • 摘要: 本研究分别以黄毛草莓叶片和茎尖生长点为外植体进行愈伤组织的诱导,并通过比较茎尖愈伤组织在不同培养基以及不同植物激素组合下的生长情况,为建立黄毛草莓高效快速的繁殖体系,筛选愈伤组织诱导的最适培养基奠定基础. 结果表明,与1/2MS培养基相比,MS培养基作为基础培养基(0.4 mg/L TDZ+0.2 mg/L 6-BA条件下)诱导的愈伤组织效果最佳;以MS为基本培养基,通过4因素3水平L9(34)正交实验研究不同浓度组合的4种植物激素对黄毛草莓愈伤组织诱导率的影响. 结果表明2,4-D对黄毛草莓叶片愈伤组织的诱导影响最大. 黄毛草莓叶片愈伤组织诱导的最优培养基为MS+0.4 mg/L TDZ+0.2 mg/L 6-BA+0.15 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L NAA;NAA对黄毛草莓茎尖愈伤组织的诱导影响最大,黄毛草莓茎尖愈伤组织诱导的最优培养基为MS+0.2 mg/L TDZ+0.6 mg/L 6-BA+0.15 mg/L 2,4-D+0.6 mg/L NAA.
  • 图 1  不同培养基诱导黄毛草莓叶片愈伤组织情况(25 d)

    Figure 1.  Callus induction from leaf on different medium (25 d)

    图 2  不同激素浓度配比下黄毛草莓茎尖诱导愈伤组织的情况(22 d)

    Figure 2.  Callus induction from shoot-tips of Fragaria nilgerrensis under different hormone concentrations (22 d)

    图 3  黄毛草莓茎尖愈伤组织诱导最优培养基与诱导率最高培养基生长情况比较(30 d)

    Figure 3.  Comparison of shoot-tips callus growth between optimum medium and highest induction rate medium in F. nilgerrensis (30 d)

    图 4  不同激素浓度配比下黄毛草莓叶片诱导愈伤组织的情况(21 d)

    Figure 4.  Callus induction from leaf of Fragaria nilgerrensis under different hormone concentrations (21 d)

    图 5  黄毛草莓叶片愈伤组织诱导最优培养基与诱导率最高培养基生长情况比较(30 d)

    Figure 5.  Comparison of leave callus growth between optimum medium and highest induction rate medium in F. nilgerrensis (30 d)

    表 1  诱导黄毛草莓叶片与茎尖愈伤组织培养基

    Table 1.  Callus medium for leaf and shoot tip induction in Fragaria nilgerrensis mg/L

    培养基ρ(TDZ)ρ (6-BA)
    MS0.40.2
    1/2MS0.40.2
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    表 2  正交试验因素水平L9(34

    Table 2.  Orthogonal test factor level L9(34) mg/L

    水平A ρ(TDZ)B ρ(6-BA)C ρ(2,4-D)D ρ(NAA)
    10.20.20.150.3
    20.40.40.3 0.6
    30.60.60.450.9
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    表 3  不同基本培养基对黄毛草莓诱导愈伤组织的影响

    无菌苗培养基ρ(TDZ)/
    (mg·L−1)
    ρ(6-BA)/
    (mg·L−1)
    接种数出愈数愈伤组织诱导率/%
    叶片MS0.40.2504284
    1/2MS0.40.2501020
    茎尖MS0.40.2463167
    1/2MS0.40.246 817
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    表 4  不同质量浓度配比的激素对茎尖愈伤组织诱导率的影响

    Table 4.  Effects of different concentrations of hormones on callus induction from shoot tips

    试验
    编号
    A ρ(TDZ)/
    (mg·L−1)
    B ρ(6-BA)/
    (mg·L−1)
    C ρ(2,4-D)/
    (mg·L−1)
    D ρ(NAA)/
    (mg·L−1)
    接种数出愈数愈伤组织诱导率/%
    10.20.20.150.3633454
    20.20.40.30.6684667.6
    30.20.60.450.9592339
    40.40.20.30.9631015.9
    50.40.40.450.3581525.9
    60.40.60.150.6705680
    70.60.20.450.6754560
    80.60.40.150.965 710.8
    90.60.60.30.3562137.5
    K153.53343.348.26739.133
    K240.634.76740.33369.2
    K336.152.16741.63338.3
    R17.43317.47.93430.9
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    表 5  验证试验

    Table 5.  Validation tests

    培养基接种数出愈数愈伤组织诱导率/%
    A1B3C1D2201890
    6号201785
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    表 6  不同浓度配比的激素对愈伤组织诱导率的影响

    Table 6.  Effects of different concentrations of hormones on callus induction rate

    试验
    编号
    A ρ(TDZ)/
    (mg·L−1)
    B ρ(6-BA)/
    (mg·L−1)
    C ρ(2,4-D)/
    (mg·L−1)
    D ρ(NAA)/
    (mg·L−1)
    接种数出愈数愈伤组织诱导率/%
    10.20.20.150.2706085.7
    20.20.40.30.4645382.8
    30.20.60.450.6695681.2
    40.40.60.30.2655584.6
    50.40.20.450.4594983.1
    60.40.40.150.6726286.1
    70.60.40.450.2615183.6
    80.60.60.150.4665684.8
    90.60.20.30.6635384.1
    K183.23384.63385.53384.3
    K284.683.56783.83384.167
    K384.16783.882.63383.533
    R1.3671.0662.90.767
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    表 7  验证试验

    Table 7.  Validation tests

    培养基接种数出愈数愈伤组织诱导率/%
    A2B1C1D1201995
    6号201785
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-08-21
  • 录用日期:  2019-11-15
  • 网络出版日期:  2020-02-11
  • 刊出日期:  2020-03-01

黄毛草莓愈伤组织诱导条件优化

    作者简介:代雄伟(1995−)男,云南人,硕士生,研究方向为草莓种质资源收集
    通讯作者: 陶磅, taopang@sina.com
    通讯作者: 乔琴, qiaoqin@ynu.edu.cn
  • 1. 云南大学 农学院,云南 昆明 650091
  • 2. 云南省农业科学院 园艺作物研究所,云南 昆明 650205

摘要: 本研究分别以黄毛草莓叶片和茎尖生长点为外植体进行愈伤组织的诱导,并通过比较茎尖愈伤组织在不同培养基以及不同植物激素组合下的生长情况,为建立黄毛草莓高效快速的繁殖体系,筛选愈伤组织诱导的最适培养基奠定基础. 结果表明,与1/2MS培养基相比,MS培养基作为基础培养基(0.4 mg/L TDZ+0.2 mg/L 6-BA条件下)诱导的愈伤组织效果最佳;以MS为基本培养基,通过4因素3水平L9(34)正交实验研究不同浓度组合的4种植物激素对黄毛草莓愈伤组织诱导率的影响. 结果表明2,4-D对黄毛草莓叶片愈伤组织的诱导影响最大. 黄毛草莓叶片愈伤组织诱导的最优培养基为MS+0.4 mg/L TDZ+0.2 mg/L 6-BA+0.15 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L NAA;NAA对黄毛草莓茎尖愈伤组织的诱导影响最大,黄毛草莓茎尖愈伤组织诱导的最优培养基为MS+0.2 mg/L TDZ+0.6 mg/L 6-BA+0.15 mg/L 2,4-D+0.6 mg/L NAA.

English Abstract

  • 草莓(Fragaria ananassa Duch.)隶属于蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria L.),是多年生草本植物,在园艺学上属于浆果类果树[1],具有较高的经济价值和营养价值. 草莓在我国的栽培面积非常广泛,仅次于同为浆果类的葡萄[2], 但相比于其他种类的水果,草莓的品种相对单一. 此外,由于多年种植会导致草莓品种种性退化、病毒病侵染严重、畸形果的比例增加和口感逐渐变差等情况的发生,从而严重影响果农的经济收益以及草莓品种的优化[3].

    黄毛草莓(Fragaria nilgerrensis Schltdl)为蔷薇科草莓属的多年生二倍体野生草莓,是我国西南地区重要的野生白果草莓资源. 黄毛草莓独特的水蜜桃香味、白色浆果和较强的抗寒、抗旱、抗病性等特点,使之在拓宽栽培草莓遗传背景方面具有很大的潜力[4].

    草莓多以无性繁殖为主,而长期无性繁殖极易导致病毒在草莓植株体内进行累积,从而出现植株矮化、果实畸形、病斑出现、种性退化,不利于推广优良品种[5]. 与传统自繁方式相比,草莓组织培养技术不仅繁殖速度快、系数大,而且可以获得脱毒苗,保持品种优良特性[6]. 因此,对于草莓组织培养技术的研究尤为重要,而影响组培育苗成败的关键因素便是愈伤组织分化. 愈伤组织培养不仅是一种植物快繁的新手段,同时也是植物改良,种质保存和次生代谢产物研究的理想手段[7].

    1978年,日本学者加古顺治最先报道了利用花药经过愈伤组织分化出不定芽形成脱毒草莓植株[3]. 王燕等以黄毛草莓匍匐茎茎尖为材料,筛选出了适宜黄毛草莓丛生芽增殖快繁和离体生根的培养基[8]. 同时,刘玲等以黄毛草莓叶片为材料,筛选出了适宜黄毛草莓离体叶片不定芽再生的培养基[9]. 国内外对于草莓愈伤组织的研究多集中于章姬、红颜和法兰地等栽培种[10],但关于野生黄毛草莓愈伤组织的研究尚未见报道. 本文通过单因素实验对MS培养基和1/2MS培养基进行筛选,并利用TDZ(噻苯隆)、6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)、2,4-D(二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)4种激素之间的不同浓度组合来设计正交实验,以期筛选出黄毛草莓叶片和茎尖诱导愈伤组织诱导的最适培养条件.

    • 研究试验材料黄毛草莓实生苗于2018年采自昆明市呈贡区云南大学农学院培养室,愈伤组织诱导所用外植体采自黄毛草莓匍匐茎初代培养的组培苗.

    • 为了减少污染率和消毒对于外植体造成的损伤,本研究愈伤组织诱导材料都来自于无菌苗.

      选取黄毛草莓匍匐茎茎尖作为外植体,先用10%的洗洁精浸泡5 min,在流动的自来水下冲洗30 min后,用75%的酒精消毒20~25 s;接着用无菌水清洗1次,0.1%的升汞处理5~7 min,无菌水冲洗5~8次,每次1 min;最后用灭菌滤纸吸去茎尖上的水分,消毒后的材料待用.

      待外植体在培养基内生长40 d后,选取生长健壮、长势一致的组培苗作为愈伤组织诱导材料.

    • 培养箱温度白天控制在(25±2)℃,黑夜控制在(20±2)℃,光照强度为1 500~2 000 lx,白天光照时间14 h,黑夜避光10 h.

    • 分别以MS培养基、1/2MS培养基为基本培养基,添加0.4 mg/L TDZ, 0.2 mg/L 6-BA筛选适合黄毛草莓叶片与茎尖诱导愈伤组织的基本培养基(表1).

      培养基ρ(TDZ)ρ (6-BA)
      MS0.40.2
      1/2MS0.40.2

      表 1  诱导黄毛草莓叶片与茎尖愈伤组织培养基

      Table 1.  Callus medium for leaf and shoot tip induction in Fragaria nilgerrensis mg/L

    • 以正交实验因素水平表为依据,采用L9(34)正交表配制9种培养基(表2). 叶片剪成0.8~1.2 cm的方块状,在无菌环境下接种于培养基中,每种培养基接种20瓶,每瓶接种5~6个,重复3次;在解剖镜下切取0.2~0.5 mm的茎尖生长点,每瓶接种4~5个茎尖生长点,重复3次. 两种材料的愈伤组织诱导都经过7 d的暗培养后转入正常光下培养23 d,分别统计出愈伤组织诱导率并且观察愈伤组织的长势.

      水平A ρ(TDZ)B ρ(6-BA)C ρ(2,4-D)D ρ(NAA)
      10.20.20.150.3
      20.40.40.3 0.6
      30.60.60.450.9

      表 2  正交试验因素水平L9(34

      Table 2.  Orthogonal test factor level L9(34) mg/L

    • 正交试验是一种均一性设计实验,无法包含所有处理组合,所以最优培养基可能并未显现出来. 为验证正交试验结果显示的激素配比是否为最优组合,配制20瓶正交培养基与诱导愈伤组织长势最好的培养基进行比较,对比愈伤组织的长势以及诱导率.

    • 经过30 d的诱导培养后进行统计,相关结果利用Excel进行处理和分析.

      愈伤组织诱导率(%)=(产生愈伤组织外植体数/接种外植体的总数)×100%

    • 将生长健壮、长势一致的黄毛草莓组培苗叶片与茎尖生长点接种到以MS培养基与1/2MS培养基上. 经过暗处理培养7 d后转入光照下培养,2 d后大部分叶片开始卷曲,25 d后叶片边缘开始出现一些黄色的松散颗粒状愈伤(图1A),茎尖周围开始出现灰色的颗粒状愈伤(图1B),暗处理和正常光照培养30 d后统计愈伤组织诱导率并进行记录.

      图  1  不同培养基诱导黄毛草莓叶片愈伤组织情况(25 d)

      Figure 1.  Callus induction from leaf on different medium (25 d)

      通过对表3的分析可知,在MS培养基上,叶片和茎尖愈伤组织发生率程度远高于1/2MS培养基,表明MS最适宜黄毛草莓无菌苗诱导愈伤组织的形成.

      无菌苗培养基ρ(TDZ)/
      (mg·L−1)
      ρ(6-BA)/
      (mg·L−1)
      接种数出愈数愈伤组织诱导率/%
      叶片MS0.40.2504284
      1/2MS0.40.2501020
      茎尖MS0.40.2463167
      1/2MS0.40.246 817

      表 3  不同基本培养基对黄毛草莓诱导愈伤组织的影响

    • 在MS基本培养基中分别加入不同质量浓度的TDZ、6-BA、2,4-D、NAA植物激素,在暗培养后的15 d,茎尖周围也会开始出现少量金黄色的松散状愈伤(图2),再过7 d后愈伤成块,此时统计愈伤组织诱导率.

      图  2  不同激素浓度配比下黄毛草莓茎尖诱导愈伤组织的情况(22 d)

      Figure 2.  Callus induction from shoot-tips of Fragaria nilgerrensis under different hormone concentrations (22 d)

      通过对表4的观察结果分析,极差R的值越大表示该因素的影响也越大,由此可知对黄毛草莓茎尖诱导愈伤组织的影响为:NAA>TDZ>6-BA>2,4-D,说明萘乙酸(NAA)对于黄毛草莓茎尖的愈伤组织诱导率的影响最大. 表4显示当NAA浓度逐渐增大时,愈伤组织诱导率呈现先增加后降低的变化趋势,当NAA质量浓度为0.6 mg/L时愈伤组织诱导率最高. K值愈大说明激素水平愈高,结果显示TDZ的均值K1>K2>K3,6-BA的均值K3>K1>K2,2,4-D的均值K1>K3>K2,NAA的均值K2>K1>K3,故黄毛草莓茎尖愈伤组织诱导的最佳激素组合为A1B3C1D2. 同时,通过图2可以看出,在不同激素(植物生长调节剂)配比的培养基下,黄毛草莓茎尖诱导愈伤组织的过程中出现颜色由浅至深的现象,并且愈伤组织的松软程度也不一样,有的质地较硬,有的出现褐化现象,甚至有的愈伤组织在生长的过程中伴随着丛生芽的分化.

      试验
      编号
      A ρ(TDZ)/
      (mg·L−1)
      B ρ(6-BA)/
      (mg·L−1)
      C ρ(2,4-D)/
      (mg·L−1)
      D ρ(NAA)/
      (mg·L−1)
      接种数出愈数愈伤组织诱导率/%
      10.20.20.150.3633454
      20.20.40.30.6684667.6
      30.20.60.450.9592339
      40.40.20.30.9631015.9
      50.40.40.450.3581525.9
      60.40.60.150.6705680
      70.60.20.450.6754560
      80.60.40.150.965 710.8
      90.60.60.30.3562137.5
      K153.53343.348.26739.133
      K240.634.76740.33369.2
      K336.152.16741.63338.3
      R17.43317.47.93430.9

      表 4  不同质量浓度配比的激素对茎尖愈伤组织诱导率的影响

      Table 4.  Effects of different concentrations of hormones on callus induction from shoot tips

      比较最优组合A1B3C1D2与正交试验中最优的6号培养基出愈率, 结果显示A1B3C1D2组合的愈伤组织诱导率达到了90%,略高于正交表中愈伤组织诱导率最高的6号培养基85%(表5). 而从愈伤组织的形态来看(图3),6号培养基诱导的愈伤组织为乳白色,且较为疏松,而A1B3C1D2诱导的愈伤组织为浅绿色,且较为密集,长势明显更好. 这表明A1B3C1D2组合的培养基的确比6号培养基更适合黄毛草莓茎尖诱导愈伤组织的形成,所以黄毛草莓茎尖诱导愈伤组织的最优培养基为:MS+0.2 mg/L TDZ+0.6 mg/L 6-BA+0.15 mg/L 2,4-D+0.6 mg/L NAA.

      图  3  黄毛草莓茎尖愈伤组织诱导最优培养基与诱导率最高培养基生长情况比较(30 d)

      Figure 3.  Comparison of shoot-tips callus growth between optimum medium and highest induction rate medium in F. nilgerrensis (30 d)

      培养基接种数出愈数愈伤组织诱导率/%
      A1B3C1D2201890
      6号201785

      表 5  验证试验

      Table 5.  Validation tests

    • 在MS基本培养基中分别加入不同浓度的TDZ、6-BA、2,4-D、NAA植物激素,暗培养7 d后叶片开始卷曲,转入正常光照下处理14 d叶片上出现黄色的松散状愈伤(图4),再过7 d后愈伤布满叶片,此时统计愈伤组织诱导率.

      图  4  不同激素浓度配比下黄毛草莓叶片诱导愈伤组织的情况(21 d)

      Figure 4.  Callus induction from leaf of Fragaria nilgerrensis under different hormone concentrations (21 d)

      通过对表6的观察结果分析,极差R的值越大表示该因素的影响也越大,因而对黄毛草莓叶片诱导愈伤组织的影响为:2,4-D>TDZ>6-BA>NAA,说明二氯苯氧乙酸(2,4-D)对于黄毛草莓叶片的愈伤组织诱导率的影响最大. 表6显示,当2,4-D浓度越大时愈伤组织诱导率越低. K值愈大就说明水平愈高,由此可知TDZ的均值K2>K3>K1,6-BA的均值K1>K3>K2,2,4-D的均值K1>K2>K3,NAA的均值K1>K2>K3,故黄毛草莓叶片愈伤组织诱导的最佳激素组合为A2B1C1D1. 同时,通过图4可以看出,在不同激素配比的培养基下,黄毛草莓叶片在诱导愈伤组织生长的过程中会出现由深绿至鲜绿色的现象,并且愈伤组织的疏松程度是逐渐变得密集,同时有的叶片仅仅出现卷曲而并未有明显愈伤生成的现象,这说明激素配比的不同对生成愈伤组织的影响较大.

      试验
      编号
      A ρ(TDZ)/
      (mg·L−1)
      B ρ(6-BA)/
      (mg·L−1)
      C ρ(2,4-D)/
      (mg·L−1)
      D ρ(NAA)/
      (mg·L−1)
      接种数出愈数愈伤组织诱导率/%
      10.20.20.150.2706085.7
      20.20.40.30.4645382.8
      30.20.60.450.6695681.2
      40.40.60.30.2655584.6
      50.40.20.450.4594983.1
      60.40.40.150.6726286.1
      70.60.40.450.2615183.6
      80.60.60.150.4665684.8
      90.60.20.30.6635384.1
      K183.23384.63385.53384.3
      K284.683.56783.83384.167
      K384.16783.882.63383.533
      R1.3671.0662.90.767

      表 6  不同浓度配比的激素对愈伤组织诱导率的影响

      Table 6.  Effects of different concentrations of hormones on callus induction rate

      比较最优组合A2B1C1D1与正交试验中诱导率最高的6号培养基进行比较,结果显示A2B1C1D1组合的愈伤组织诱导率达到了95%,高于正交表中的6号培养基85%(表7). 且从愈伤组织的形态来看(图5),6号培养基诱导的愈伤组织覆盖率较低,叶片存在明显的原型状态,而A2B1C1D1诱导的愈伤组织覆盖率明显较高,且较为密集,长势明显更好. 这表明A2B1C1D1组合的培养基的确比6号培养基更适合黄毛草莓叶片诱导愈伤组织的形成,所以黄毛草莓叶片诱导愈伤组织的最优培养基为:MS+0.4 mg/L TDZ+0.2 mg/L 6-BA+0.15 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L NAA.

      图  5  黄毛草莓叶片愈伤组织诱导最优培养基与诱导率最高培养基生长情况比较(30 d)

      Figure 5.  Comparison of leave callus growth between optimum medium and highest induction rate medium in F. nilgerrensis (30 d)

      培养基接种数出愈数愈伤组织诱导率/%
      A2B1C1D1201995
      6号201785

      表 7  验证试验

      Table 7.  Validation tests

    • 我们的研究表明MS培养基和1/2MS培养基均能使黄毛草莓叶片和茎尖生长点诱导出愈伤组织,但从实验结果可以得出MS培养基的效果明显强于1/2MS培养基. 这一结果与张爱丽等以章姬草莓茎段为材料研究最适愈伤培养基的基本培养基相符[10]. 结合王燕等的结果综合来看,1/2MS培养基更适于用来诱导草莓生根培养[8].

      蔷薇科植物的愈伤组织研究结果表明,不同外植体的愈伤组织诱导效果存在差异[11-12]. 对比黄毛草莓叶片与茎尖的愈伤组织诱导发现,叶片更容易诱导出愈伤组织,这一结果与宋金锋等所报道的晶瑶草莓叶片高诱导率相符[13],可能是因为叶片中叶脉作为物质交换与运输的组织,最早感受到生理生化环境的变化从而脱分化产生愈伤组织[14],但愈伤组织团明显没有茎尖诱导生成的愈伤组织团密集,长势也较茎尖愈伤组织差. 这一结果与戴小云等研究的核桃叶片愈伤质量没有叶柄愈伤质量好以及尤润等以华木莲叶片诱导愈伤的情况相符[15-16], 这可能是由于叶片存在脱分化的过程.

      本试验筛选出黄毛草莓茎尖诱导愈伤组织的最适培养条件为:MS+0.2 mg/L TDZ+0.6 mg/L 6-BA+0.15 mg/L 2,4-D+0.6 mg/L NAA,同时NAA对于黄毛草莓茎尖愈伤组织的诱导影响最大,在NAA为0.6 mg/L时愈伤组织诱导率最高. 正如前人的研究表明,单独使用NAA能促进植物愈伤组织中总酚、总黄酮的积累,而适量结合6-BA能获得最高的活性物质含量[17]. 黄毛草莓部分愈伤组织在生长的过程中伴随着丛生芽的分化,这可归因于6-BA具有促进细胞的分裂与分化同时提高出芽率的作用,这与张爱丽等所报道的以章姬草莓茎段为材料可同步进行愈伤组织诱导和丛芽分化的结果相符[10].

参考文献 (17)

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