基于分子模拟技术筛选木姜子属阿朴菲型生物碱的COX-2抑制剂研究(I)

薛孟祺 杨念琦 字慧敏 杨平 杨靖华 汪云松

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基于分子模拟技术筛选木姜子属阿朴菲型生物碱的COX-2抑制剂研究(I)

    作者简介: 薛孟祺(1996−),男,陕西人,硕士生,主要从事天然药物化学研究;
    通讯作者: 杨靖华, yangjh@ynu.edu.cn ; 汪云松, wangys@ynu.edu.cn
  • 中图分类号: 0629.34

Primary virtual screening of natural inhibitors from aporphine alkaloids in litsea against COX-2

    Corresponding author: YANG Jing-hua, yangjh@ynu.edu.cn ;WANG Yun-song, wangys@ynu.edu.cn
  • CLC number: 0629.34

  • 摘要: 环氧合酶-2(COX-2)是炎症治疗中的一个重要靶点,但目前市面上的COX-2抑制剂存在心血管副作用,开发新型低毒的COX-2抑制剂十分必要. 该文运用Discovery Studio 2016(DS)与Molegro Virtual Docker 6.0(MVD)分子模拟软件,采用构建药效团与分子对接的方法,对传统药用植物木姜子属(Litsea)中分离到的14个特征性阿朴菲生物碱展开研究. 研究发现8个阿朴菲生物碱分子( 1 , 3 , 4 , 5 , 8 , 9 , 11 , 12 )与最优药效团可以匹配,其中单甲氧基取代的3个阿朴菲生物碱( 1 - 3 )在分子对接中得分较高,有进一步研究的价值. 随甲氧基的增多,对接得分逐步降低. 研究结果揭示木姜子属阿朴菲生物碱可能是具有潜在COX-2抑制作用的一类分子,值得进一步深入研究.
  • 图 1  训练集化合物及其IC50

    Figure 1.  Training set compounds and their IC50 values

    图 2  阿朴菲生物碱114结构

    Figure 2.  The structures of aporphine alkaloids 114 from Litsea plants.

    图 3  8个阿朴菲生物碱与药效团10的匹配图

    Figure 3.  Matching diagram of 8 aporphine alkaloids and pharmacophore 10

    图 4  123和阳性药物艾瑞昔布,罗非昔布以及赛来昔布与COX-2相互作用2D图

    Figure 4.  COX-2 2D interactions with 1, 2, 3 and positive drugs of ericoxib, rofecoxib and celecoxib

    表 1  配体SC-558最优的两种对接条件

    Table 1.  Optimal docking conditions for ligand SC-558

    分子算法半径R-Score氢键RMSD
    SC-5581 Moldock Score/
    Moldock Optimmizer
    12−129.241−3.491.165
    SC-5582 Moldock Score/
    Moldock SE
    12−129.2 −3.481.164
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    表 2  10个药效团特征表

    Table 2.  The pharmacophore characteristics table

    药效团编号药效特征打分值
    01RHAA53.758
    02RHAA53.648
    03RHHA51.678
    04RHHA51.423
    05RHHA51.352
    06RHHA51.321
    07RHAA51.049
    08RHHA51.011
    09RHHA51.011
    10RHAA50.907
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    表 3  药效团得分结果

    Table 3.  The pharmacophore score results

    药效团编号HtHaA/%Y/%NCAI
    01131033.376.93.311.092 3
    02131136.784.63.641.335 88
    03221756.777.33.321.882 44
    04221756.777.33.321.882 44
    05231756.773.93.181.803 06
    06211550 71.43.071.535
    07261963 73.13.141.978 2
    08201653 80 3.441.950 48
    09231756.773.93.181.803 06
    10231860 78.33.362.016
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    表 4  阿朴菲生物碱1~14与药效团匹配情况

    Table 4.  Aporphine alkaloids 1—14 and pharmacophores match

    生物碱编号Fit Value生物碱编号Fit Value
    11.370 3281.527 35
    31.517 3591.500 57
    41.500 57111.407
    51.527 35121.578 57
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    表 5  阿朴菲生物碱分子1~14对接得分

    Table 5.  Aporphine alkaloid 1—14 molecular docking score

    分子编号平均打分分子编号平均打分
    1−95.821 810−79.192 5
    2−81.230 311−61.655
    3−87.128 12−58.746 4
    4−74.640 513−67.956 8
    5−59.297 314−51.410 8
    6−75.036 8A−89.841 5
    7−77.552 9S−108.122
    8−65.294 9L−70.378 5
    9−74.672 7
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-10-31
  • 录用日期:  2020-01-18
  • 网络出版日期:  2020-02-10
  • 刊出日期:  2020-03-01

基于分子模拟技术筛选木姜子属阿朴菲型生物碱的COX-2抑制剂研究(I)

    作者简介:薛孟祺(1996−),男,陕西人,硕士生,主要从事天然药物化学研究
    通讯作者: 杨靖华, yangjh@ynu.edu.cn
    通讯作者: 汪云松, wangys@ynu.edu.cn
  • 教育部自然资源药物化学重点实验室,云南大学 化学科学与工程学院·药学院,云南 昆明 650091

摘要: 环氧合酶-2(COX-2)是炎症治疗中的一个重要靶点,但目前市面上的COX-2抑制剂存在心血管副作用,开发新型低毒的COX-2抑制剂十分必要. 该文运用Discovery Studio 2016(DS)与Molegro Virtual Docker 6.0(MVD)分子模拟软件,采用构建药效团与分子对接的方法,对传统药用植物木姜子属(Litsea)中分离到的14个特征性阿朴菲生物碱展开研究. 研究发现8个阿朴菲生物碱分子( 1 , 3 , 4 , 5 , 8 , 9 , 11 , 12 )与最优药效团可以匹配,其中单甲氧基取代的3个阿朴菲生物碱( 1 - 3 )在分子对接中得分较高,有进一步研究的价值. 随甲氧基的增多,对接得分逐步降低. 研究结果揭示木姜子属阿朴菲生物碱可能是具有潜在COX-2抑制作用的一类分子,值得进一步深入研究.

English Abstract

  • 炎症反应是机体应对外来物入侵或者自身组织损伤修复的一种自我保护手段,当机体遭受外来微生物感染时,血管会发生扩张,大量的免疫细胞会透过血管壁被募集到感染组织中消灭入侵物对人体所造成的影响,一般伴有肿胀的疼痛与发热,以及部分功能性的紊乱[1]. 当威胁因素被消除时,免疫细胞恢复到正常的数量,对人体的影响也会随之消失. 但有时炎症反应不能正常停止,使得免疫细胞长时间停留在组织中,则易患自身免疫病,慢性增生性炎症和组织过度损伤[2],严重的可能导致病人的死亡.

    研究表明,当外来物感染或者组织损伤时,机体会自发产生一系列炎症介质,有细胞因子、趋化因子、生物活性胺、类花生酸和蛋白水解级联产物等,它们会激发炎症反应[1]. 当这些炎症介质停止分泌时,炎症反应也将终止. 前列腺素是一种非常重要的炎症介质,在一系列炎症反应中都能检测到它的存在[1]. 环氧合酶(COX)是前列素腺素合成中的一个重要酶,它在人体中存在2种亚型COX-1与COX-2. 其中COX-1在人体细胞中组成性表达,参与人体内环境稳态的调节[3],而COX-2是炎症组织中前列腺素形成的主要来源[4].

    目前COX-2是慢性炎症治疗中的一个重要靶点,已有很多针对于该靶点的药物上市. 但这些药物中存在严重的副作用,如强烈的心血管副作用导致了罗非昔布与依托昔布的退市[5]. 因此,研究新型的COX-2抑制剂显得十分有意义.

    樟科(Lauraceae)木姜子属(Litsea)植物作为传统中药资源,在医书中记载了该属多种植物具有抗炎作用,如豹皮樟对腰酸腿痛、风湿性关节痛有较好疗效;山鸡椒有祛风止寒,消肿化瘀的功效[6-7]. 国内外学者对该属植物化学开展了系统研究,研究表明阿朴菲生物碱是木姜子属植物的特征性成分之一[7]. 已有实验报道阿朴菲型生物碱boldine对小鼠爪水肿模型具有抗炎与止痛功效[8-9]. 为系统开展阿朴菲生物碱抗炎作用研究,本文运用Discovery Studio 2016(DS)软件,根据Binding Data Base数据库中真实的COX-2活性数据,创建针对COX-2抑制剂的最优药效团,将阿朴菲生物碱与最优药效团进行适配,看其结构是否与最优药效团匹配. 紧接着运用计算机分子对接软件Molegro Virtual Docker6.0(MVD)对木姜子属的阿朴菲生物碱与COX-2进行对接,以上市的阳性药物打分进行对比. 由于木姜子属中阿朴菲生物碱数量与取代类型均较多,本文目前针对N上连接H的14个阿朴菲生物碱开展研究.

    • 登录Binding Data Base数据库,选择Find Compounds for My Targets选项,然后在Add search criterion复选框中选择Uniprotkb,之后登录UniProt网站查找COX-2蛋白代码为P00403. 将找到的代码输入Binding Databases数据库查找到有关于COX-2蛋白的化合物227个,将其保存为SDF格式的3D文件备用.

    • 从Binding DataBase数据库下载的分子中,优先挑选活性高的化合物,并本着结构多样性的原则,最终挑选出6个化合物建立训练集,训练集化合物结构及活性见图1.

      图  1  训练集化合物及其IC50

      Figure 1.  Training set compounds and their IC50 values

    • 从之前227个针对COX-2的化合物中随机选取30个有活性的化合物,并且再加入99个与该靶点不相关的化合物,一共129个化合物组成测试集. 以此来检测建立药效团模型的可靠性,训练集与测试集中不能有重复的化合物. 选取化合物时,应本着活性梯度大,并且结构多样性的原则.

    • 使用Discovery Studio 2016软件对训练集化合物进行构象分析. 定义训练集中所有化合物的Principal值为2,MaxOmitFeat值为0. Principal值越高表示化合物的活性越好,化合物的结构特征对药效团的贡献越大. MaxOmitFeat表示应该忽略的无效结构,它的值越大表示分子结构特征对药效团的贡献越小. 使用Best分析方法,能量阈值设置为20. 药效团特征元素选择hydrogen bond acceptor (氢键受体),hydrogen bond donor(氢键供体),hydrophobic region(疏水基团),positive ionizable (正电中心),ring aromatic(芳香环)这5个元素. maximum excluded volumes(排除体积)设置为3,生成药效团最大数量设定为10[10-13].

    • 利用生成的10个药效团分别与测试集的129个化合物进行匹配,选取匹配结果最好的药效团为最优药效团,评价依据CAI(综合评价指数)进行评价,CAI值越大,证明药效团越好,CAI依据如下公式进行计算[14-15].

      ${{\rm{CAI}} = N \times A,}$

      ${N = \left( {{H_{\rm{a}}} \times D} \right)/\left( {{H_{\rm{t}}} \times A} \right),}$

      ${Y = \left( {{H_{\rm{a}}}/{H_{\rm{t}}}} \right) \times 100\% ,}$

      $A = \left( {{H_{\rm{a}}}/A} \right) \times {\rm{ }}100\% .$

      其中N为有效辨识指数,A为活性成分命中率. Ha表示药效团命中活性化合物的个数,Ht为药效团命中的所用化合物的个数,A为测试集中活性化合物的个数,D为测试集化合物的总数. Y代表有效命中率.

    • 使用上一步得到的最优药效团对14个N-H型阿朴菲生物碱进行匹配,观测其结构是否与最优药效团匹配.

    • 本文中所要研究的蛋白COX-2从PDB数据库中下载,蛋白编号为6COX. 将其作为受体模型,保存为PDB格式备用.

    • 目前从木姜子属中分离得到生物碱分子63个,包括53个为阿朴菲类生物碱[7, 16],本文针对其中14个N-H型阿朴菲生物碱开展研究(具体结构见图2). 采用ChemDraw 2014软件绘制其2D结构,再将其导入到Chem3D 2014软件中,采用MMFF94算法计算出化合物的最低能量构型,将最大迭代次数设置为5 000,最大RMS梯度设置为0.5. 将设置好的3D结构保存为mol2格式备用.

      图  2  阿朴菲生物碱114结构

      Figure 2.  The structures of aporphine alkaloids 114 from Litsea plants.

    • Molegro Virtual Docker 6.0(MVD)的对接精度高于市面上的绝大多数软件[17],故使用其进行分子对接. 将蛋白中原有的配体SC-558导出到Chem3D软件中,对其结构进行修正,并用MMFF94算法得到其最低能构象,重新导入到蛋白中,利用不同算法的组合和条件的限定,反复尝试,最终得到重现性较好的两种对接方法(表1).

      分子算法半径R-Score氢键RMSD
      SC-5581 Moldock Score/
      Moldock Optimmizer
      12−129.241−3.491.165
      SC-5582 Moldock Score/
      Moldock SE
      12−129.2 −3.481.164

      表 1  配体SC-558最优的两种对接条件

      Table 1.  Optimal docking conditions for ligand SC-558

    • RMSD越小,说明对接结果与原配体在蛋白中的实际情况越吻合. 因此MVD对接时选取表1第2种对接方法对配体库中14个分子进行对接,以上市药物艾瑞昔布(A)、塞来昔布(S)以及罗非昔布(L)为阳性对照. 对接结果依据Rerank Score (R-Score)评价. 在对接时,为了保证得分的可靠性,设置得到每个分子得分最高的前3个结果,取其平均值作为最终得分. R-Score数值为负,证明分子与蛋白可以结合,数值越小,证明亲和性越大[18-19].

    • 在对COX-2药效团研究中,训练集分子共生成了10个药效团模型,结果见表2. 10个药效团可以分为两类,第1类药效团含有1个芳香平面(R),1个疏水基团(H),以及2个氢键受体(A). 第2类药效团包括1个芳香平面(R),2个疏水基团(H),以及1个氢键受体(A),且训练集中的6个分子都参与了药效团的构建. 最后药效团01具有最高的打分值,说明该药效团与化合物具有更好的匹配性.

      药效团编号药效特征打分值
      01RHAA53.758
      02RHAA53.648
      03RHHA51.678
      04RHHA51.423
      05RHHA51.352
      06RHHA51.321
      07RHAA51.049
      08RHHA51.011
      09RHHA51.011
      10RHAA50.907

      表 2  10个药效团特征表

      Table 2.  The pharmacophore characteristics table

      对于药效团模型的进一步评价,引入测试集中的129个分子,经过统计与计算,发现药效团10具有最大的CIA值,因此确定其为最优药效团. 药效团10共命中化合物23个,其中18个为活性化合物,由此也可以看出其具有较强的预测能力,结果见表3.

      药效团编号HtHaA/%Y/%NCAI
      01131033.376.93.311.092 3
      02131136.784.63.641.335 88
      03221756.777.33.321.882 44
      04221756.777.33.321.882 44
      05231756.773.93.181.803 06
      06211550 71.43.071.535
      07261963 73.13.141.978 2
      08201653 80 3.441.950 48
      09231756.773.93.181.803 06
      10231860 78.33.362.016

      表 3  药效团得分结果

      Table 3.  The pharmacophore score results

      接下来使用药效团10对14个阿朴菲生物碱进行匹配(见图2),共有8个分子(1, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12)可以与药效团匹配. Fit Value表示分子与药效团的匹配度,值越大表示分子与药效团越匹配,8个匹配分子的打分值均较高且非常接近,表示匹配度接近,也说明阿朴菲分子的骨架与药效团的匹配度较高,实验结果见表4. 图3为8个阿朴菲生物碱与最优药效团的匹配情况.

      图  3  8个阿朴菲生物碱与药效团10的匹配图

      Figure 3.  Matching diagram of 8 aporphine alkaloids and pharmacophore 10

      生物碱编号Fit Value生物碱编号Fit Value
      11.370 3281.527 35
      31.517 3591.500 57
      41.500 57111.407
      51.527 35121.578 57

      表 4  阿朴菲生物碱1~14与药效团匹配情况

      Table 4.  Aporphine alkaloids 1—14 and pharmacophores match

      图3中可以看出,药效团10与8个化合物的匹配情况较好.

    • 通过对接结果发现N−H型阿朴菲生物碱中甲氧基的数量对打分的结果影响较大. 从一甲氧基取代到三甲氧基取代的范围内,甲氧基的数量越少,分子的得分越高. 根据甲氧基取代的数量,将这些分子分为3类:一甲氧基取代,二甲氧基取代以及三甲氧基取代结构,见图3,对接得分结果如表5所示.

      分子编号平均打分分子编号平均打分
      1−95.821 810−79.192 5
      2−81.230 311−61.655
      3−87.128 12−58.746 4
      4−74.640 513−67.956 8
      5−59.297 314−51.410 8
      6−75.036 8A−89.841 5
      7−77.552 9S−108.122
      8−65.294 9L−70.378 5
      9−74.672 7

      表 5  阿朴菲生物碱分子1~14对接得分

      Table 5.  Aporphine alkaloid 1—14 molecular docking score

      从对接结果中发现,一取代的阿朴菲生物碱对接得分均高于罗非昔布,低于赛来昔布. 但与艾瑞昔布接近,其中1的得分高于艾瑞昔布,23得分略低于艾瑞昔布. 而二取代与三取代的阿朴菲生物碱得分则低得多. 从2D相互作用图(图4)中可以看到,化合物13与COX-2蛋白中的His90,Ser353,Leu352,Arg120,Tyr355残基可以形成氢键. 通过对比发现它们的结合模式与赛来昔布与艾瑞昔布较为类似. 艾瑞昔布主要与Arg120形成氢键,赛来昔布也与Arg120形成氢键. 而罗非昔布与Trp387与Tyr355形成氢键. 除形成氢键外,分子与蛋白还存在空间相互作用,Val523,Phe518,His90等是13与艾瑞昔布与赛来昔布的共同的作用位点. 而罗非昔布的结合模式与它们有着较大的区别. 并且罗非昔布分子中还有红色区域出现,这区域表示分子与蛋白蛋白之间不相匹配.

      图  4  123和阳性药物艾瑞昔布,罗非昔布以及赛来昔布与COX-2相互作用2D图

      Figure 4.  COX-2 2D interactions with 1, 2, 3 and positive drugs of ericoxib, rofecoxib and celecoxib

    • 在现代新药研究中,分子对接方法(molecular docking method)是重要的计算机辅助药物分子设计手段,它通过化学计量学方法模拟分子的几何结构和分子间作用力,进行分子间相互作用识别并预测受体-配体复合物结构. 分子对接技术的迅速发展,显著加快了药物研究的速度,节约了研发成本,尤其是对中草药药效物质基础的高效、快速筛选和药效作用机制研究起着重要作用[20-22]. 本文使用DS软件,利用训练集化合物构建了基于COX-2抑制剂配体结构的药效团模型,然后使用测试集化合物确定了最优药效团模型. 使用该药效团,对从木姜子属植物中分离出的14个N-H型阿朴菲生物碱分子进行匹配,发现其中的8个分子(1, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12)可以与该药效团较好匹配,并且得分十分接近,表明阿朴菲生物碱的骨架结构能够较好地与最优药效团匹配,从一定程度上证明了阿朴菲生物碱作为COX-2抑制剂的潜力. 进一步的研究中,利用MVD分子对接软件对14个分子与COX-2蛋白进行对接,研究发现对接得分与分子中甲氧基的取代数量有关,甲氧基的数量越少,则分子的得分越高. 其中一取代的3个分子与阳性对照艾瑞昔布的打分接近,有进一步的研究价值,且分子1的得分略高于艾瑞昔布. 化合物13与COX-2蛋白中的His90,Ser353,Leu352,Arg120,Tyr355残基可以形成氢键作用,艾瑞昔布主要与Arg120形成氢键,作用方式与3类似. 除形成氢键外,分子与蛋白还存在空间相互作用,Val523、Phe518、His90等是共同的作用位点. 上述研究结果表明N-H型阿朴菲生物碱,特别是其一甲氧基取代的结构具有较大的COX-2抑制潜力. 花生四烯酸经环氧合酶-2(COX-2)的代谢产物前列腺素有促炎作用,COX-2是炎症治疗中的重要靶点. 目前的研究结果揭示木姜子属阿朴菲生物碱可能是具有潜在COX-2抑制作用的化合物,值得开展深入研究.

参考文献 (22)

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