烟草花粉活力检测方法筛选

秦晓君 潘磊 牛永志 廖菊够 魏雪梅 陈志芸 杨帅 马文广 郑昀烨 陈穗云

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烟草花粉活力检测方法筛选

    作者简介: 秦晓君(1994−),女,湖北人,硕士生,主要从事植物生理与分子生物学研究;
    通讯作者: 郑昀烨, zyy@tobacco-seed.com ; 陈穗云, chensuiyun@ynu.edu.cn
  • 中图分类号: Q94-331

Screening on the methods for detecting the pollen viability of Nicotiana

    Corresponding author: ZHENG Yun-ye, zyy@tobacco-seed.com ;CHEN Sui-yun, chensuiyun@ynu.edu.cn
  • CLC number: Q94-331

  • 摘要: 为了探究出一种快速、准确测定烟草花粉活力的方法,研究以烟草栽培品种Nicotiana tabacum L 'K326'、残波烟草(N. repanda)和黄花烟草(N. rustica)的成熟花粉为材料,运用离体萌发法、FDA-PI荧光染色法、TTC染色法、I2-KI染色法以及联苯胺染色法分别对上述烟草的花粉活力进行检测. 结果表明:离体萌发法是检测烟草花粉活力最准确有效的方法;TTC染色法可以用于烟草花粉活力的快速检测;FDA-PI荧光染色法、I2-KI染色法和联苯胺染色法则不适用于烟草花粉活力的检测.
  • 图 1  不同方法检测烟草花粉活力镜检结果

    Figure 1.  Photomicrograph of different methods for detecting the pollen viability of Nicotiana

    表 1  不同染色方法检测烟草花粉活力的效果

    Table 1.  Observation effect of different methods for detecting the pollen viability of Nicotiana

    染色方法染色效果花粉形态
    FDA-PI荧光染色法着色良好,色差极明显,易鉴别清晰
    TTC染色法着色良好,色差较明显,易鉴别清晰
    I2-KI染色法着色良好,色差不明显,不易鉴别清晰
    联苯胺染色法着色较好,色差不明显,不易鉴别清晰
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    表 2  不同方法检测烟草花粉活力统计结果

    Table 2.  Statistical results of different methods for detecting the pollen viability of Nicotiana %

    检测方法K326N. repandaN. rustica
    离体萌发法 63.91 62.57 66.82
    FDA-PI荧光染色法 43.64 20.67 19.21
    TTC染色法 60.66 59.16 78.98
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-11-11
  • 录用日期:  2020-03-27
  • 网络出版日期:  2020-04-11
  • 刊出日期:  2020-05-01

烟草花粉活力检测方法筛选

    作者简介:秦晓君(1994−),女,湖北人,硕士生,主要从事植物生理与分子生物学研究
    通讯作者: 郑昀烨, zyy@tobacco-seed.com
    通讯作者: 陈穗云, chensuiyun@ynu.edu.cn
  • 1. 云南大学 云南省高校植物病虫害生物防控工程研究中心,云南 昆明 650091
  • 2. 云南省作物病虫害生物防控工程技术研究中心,云南 昆明 650091
  • 3. 玉溪中烟种子有限责任公司,云南 玉溪 653100
  • 4. 云南大学 生态与环境学院,云南 昆明 650091
  • 5. 云南省烟草农业科学研究院,云南 玉溪 653100

摘要: 为了探究出一种快速、准确测定烟草花粉活力的方法,研究以烟草栽培品种Nicotiana tabacum L 'K326'、残波烟草(N. repanda)和黄花烟草(N. rustica)的成熟花粉为材料,运用离体萌发法、FDA-PI荧光染色法、TTC染色法、I2-KI染色法以及联苯胺染色法分别对上述烟草的花粉活力进行检测. 结果表明:离体萌发法是检测烟草花粉活力最准确有效的方法;TTC染色法可以用于烟草花粉活力的快速检测;FDA-PI荧光染色法、I2-KI染色法和联苯胺染色法则不适用于烟草花粉活力的检测.

English Abstract

  • 烟草起源于中南美洲,是一种重要的经济作物,已有几百年的种植历史,除作为烟草工业的原料外,烟草中含有很多可用于医疗的活性成分. 现代科学研究已经证明,烟草具有十分重要的药用价值[1]. 此外,烟草和拟南芥一样,是分子生物学和基因工程研究的重要模式植物,是最有价值的科研生物材料之一. 烟草的野生种质资源丰富,经过长期地野外生存进化,有极强的抗病虫及抗逆能力,蕴藏着许多栽培烟草中不存在的优异基因;但与此同时许多野生烟草在自然条件下存在落花落果严重的现象,以及结实率和种子发芽率低于栽培种等繁殖问题[2]. 因此,通过杂交育种开展烟草不同种属间的远缘杂交是保护烟草种质资源、培育烟草新品种、提高烟草品质的重要手段.

    在杂交育种实践中,杂交亲本的花粉生活力高低直接影响育种成效[3]. 植物花粉活力即花粉萌发力,是指花粉在适宜条件下萌发的能力[4]. 在烟草杂交制种过程中,对花粉活力进行准确有效的检测,是保证育种工作顺利开展的重要条件. 目前常用的花粉活力检测方法主要有离体萌发法、染色法和授粉法3类. 离体萌发法基于花粉的萌发能力,以是否能够萌发并长出花粉管为花粉活力有无的判断依据,准确直观,适用范围极广. Stone等指出:花粉离体萌发法被普遍认为可以提供体内花粉生活力的最佳估计值[5]. 染色法是以花粉细胞当中的各种活性物质或者细胞膜的通透性与完整性为基础,利用针对性的染液或观测手段对花粉活力进行间接检测,操作虽简便,但其适用性和准确性在物种之间存在极大差异,不具有通用性. 授粉法则是根据花粉在柱头上的萌发情况判断花粉活性,结果比较准确,但由于授粉到每个柱头的花粉具体数量不易掌控,无法定量判断花粉的活力. 本研究运用离体萌发法、FDA-PI荧光染色法、TTC染色法、I2-KI染色法以及联苯胺染色法对烟草栽培品种Nicotiana tabacum L 'K326'(简称K326)、残波烟草(N. repanda)和黄花烟草(N. rustica)的成熟花粉进行活力检测,并以离体萌发法作为参照,将不同染色方法与之进行比较分析,以期探究出一种能够快速、准确检测烟草花粉活力的方法,为烟草杂交育种中花粉的采集、贮藏和检测等工作提供理论依据.

    • 以栽培于实验基地大棚内的烟草栽培品种K326、N. repandaN. rustica成熟花粉为试验材料. 采集始开期花药上可见裂缝的成熟花朵,收集花药,室温下晾于培养皿中滤纸上,待其花粉散出进行实验.

    • (1)离体萌发法 配制烟草花粉萌发培养基:100 mL无菌水中加10 g蔗糖、0.005 g硼酸、0.08 g琼脂,加热煮沸充分溶解,冷却后4 ℃保存备用.

      取干净凹面载玻片,向凹穴加适量培养基,用牙签沾取少量花粉涂于培养基上,轻轻搅动使花粉均匀分散其中. 在切片盒底部铺3~4层浸湿卫生纸巾,将上述接种花粉的载玻片平放于盒内隔层上,盖上盒盖,置28 ℃恒温恒湿箱中黑暗培养[6]. 根据预实验结果,3个烟草种花粉离体萌发培养时长依次为:K326 3 h、N. repanda 1.5 h、N. rustica 2 h. 培养结束后,Olympus BX51显微镜下观察萌发情况,Olympus DP73拍照.

      (2)FDA-PI荧光染色法 当活性细胞具有完整细胞膜时,荧光素二乙酸酯(FDA)水解得到的荧光素不断在细胞内积累,使细胞在蓝色激发光下发出绿色荧光. 当细胞膜受损,荧光素无法在细胞内累积,而使细胞无法发出荧光. 活性高的细胞发出强烈的绿色荧光,活性弱的细胞发光较弱. 碘化丙啶(PI)性质与FDA不同,当细胞膜完好时,它不能进入细胞内,当细胞凋亡或死亡后,因细胞膜缺损而进入细胞. PI与细胞内DNA和RNA物质相作用生成红色荧光物,使死亡细胞发出红色荧光. 通过FDA-PI双重荧光染色,在荧光显微镜下,红色与绿色区别明显[7].

      将10 mg FDA溶于少量丙酮中;用实验室纯水将其溶解至5 mL,再加入PI至终质量浓度1 mg/mL即可,4 ℃避光保存备用.

      取干净PCR管,用牙签挑取适量花粉置管底部,再向管中加入100 μL FDA-PI染色液,使用涡旋仪低速混匀. 25 ℃染色5 min后,取2~3滴于干净载玻片上,用牙签将液滴均匀涂布于玻片表面,用荧光显微镜观察染色情况,激发光和检测光波长分别为485 nm和520 nm,显示绿色荧光花粉有活力,显示红色荧光的花粉无活力[8-10].

      (3)TTC染色法 无色的氯化三苯基四氮唑(TTC)作为一种氧化还原指示剂,利用活性细胞呼吸作用所产生的脱氢酰胺(NADH2或NADPH2)而被还原为三苯基甲腊(TTF)而呈红色,活力缺失的细胞呼吸作用较弱,颜色变化不明显[11-12].

      将2% TTC染色液(Solarbio,北京)用蒸馏水稀释成0.5% TTC染色液,4 ℃避光保存备用.

      取干净PCR管,用牙签挑取适量花粉置管底部,再向管中加入200 μL 0.5% TTC染色液,使用涡旋仪低速混匀,37 ℃黑暗染色15 min后,取2~3滴于干净载玻片上,涂片后镜检观察. 有活力的花粉呈红色,无活力的花粉不着色[13].

      (4)I2-KI染色法 多数植物正常的成熟花粉粒积累较多的淀粉,碘-碘化钾(I2 -KI)溶液可以将其染成蓝色或蓝黑色,发育不良的花粉常呈畸形,往往不含淀粉或积累淀粉极少,I2-KI溶液染色呈黄褐色[14].

      称取0.25 g KI溶于10 mL蒸馏水中,待其充分溶解后,加入0.125 g I2,定容至50 mL,涡旋振荡使其充分溶解,室温避光保存备用[15].

      取干净PCR管,用牙签挑取适量花粉置管底部,再向管中加入200 μL I2-KI染色液,使用涡旋仪低速混匀,室温染色5 min后,取2~3滴于干净载玻片上,涂片后镜检观察. 蓝色花粉有活力,生活力衰弱的花粉或内含物少的花粉呈黄褐色,无活力花粉不着色[16].

      (5)联苯胺染色法 具有生活力的花粉含有活跃的过氧化物酶,此酶能够利用过氧化氢使各种多酚及芳香族胺氧化而产生红色物质使花粉被染成红色.

      取0.1 g联苯胺溶于20 mL 50%乙醇中,配成0.5%联苯胺溶液;取0.1 g α-萘酚溶于20 mL 50%乙醇中,配成0.5% α-萘酚溶液;取0.05 g Na2CO3溶于20 mL蒸馏水中,配成0.25% Na2CO3溶液;将上述3种溶液各取2 mL混合均匀配成试剂A,室温避光保存备用. 体积分数0.3%的过氧化氢为试剂B.

      取干净PCR管,用牙签挑取适量花粉置管底部,向管中加入100 μL试剂A和100 μL试剂B,使用涡旋仪低速混匀,室温开盖染色10 min,期间吹吸混匀2~3次,充分释放反应产生的气泡. 染色结束,取2~3滴于干净载玻片上,涂片后镜检观察,有活力花粉呈红色,无活力花粉不着色[17].

    • 上述每个种的每个处理均设3个生物学重复,每个重复统计3个视野.

      离体萌发法中,花粉管长度大于花粉粒直径视为萌发[18]. 统计每个视野的萌发花粉粒颗数和花粉粒总颗数,计算萌发率,求平均值作为花粉活力的指标. 花粉萌发率计算公式为:(视野中萌发的花粉粒颗数/视野中花粉粒总颗数)× 100%.

      染色法中,一般有活力的花粉会着色,而无活力的花粉不着色. 统计每个视野的着色花粉粒颗数和花粉粒总颗数,计算着色率,求平均值作为花粉活力的指标,用百分数表示.

      使用FDA-PI荧光染色法检测花粉活力时,花粉均会着色,有活力的花粉显示绿色荧光,无活力花粉显示红色荧光. 统计每个视野的绿色花粉粒颗数和花粉粒总颗数,计算绿色花粉着色率,求平均值作为花粉活力的指标,用百分数表示.

    • 在本实验中,FDA-PI荧光染色法、TTC染色法、I2-KI染色法均能对3个烟草种的花粉进行良好着色,联苯胺染色法着色效果较好. 经4种方法染色后,在显微镜下可以观察到花粉粒形态清晰,但着色后有无活力花粉的区分度在各方法中存在较大差异,如表1图1所示.

      染色方法染色效果花粉形态
      FDA-PI荧光染色法着色良好,色差极明显,易鉴别清晰
      TTC染色法着色良好,色差较明显,易鉴别清晰
      I2-KI染色法着色良好,色差不明显,不易鉴别清晰
      联苯胺染色法着色较好,色差不明显,不易鉴别清晰

      表 1  不同染色方法检测烟草花粉活力的效果

      Table 1.  Observation effect of different methods for detecting the pollen viability of Nicotiana

      图  1  不同方法检测烟草花粉活力镜检结果

      Figure 1.  Photomicrograph of different methods for detecting the pollen viability of Nicotiana

      经FDA-PI染色后,显微镜下可以观察到花粉有绿色和亮红色两种颜色,极易区分;经0.5% TTC染色后,视野中出现深红色、浅红色和无色3种花粉,易区分;经I2-KI染色后,K326和N. rustica的所有花粉均呈黄褐色,未见蓝色或蓝黑色花粉粒以及未着色花粉粒,N. repanda的花粉多数呈褐黑色,少数呈黄褐色,极少数未着色花粉粒;经联苯胺染色后,所有花粉均着色,未见未着色花粉,其中K326花粉颜色跨度较大,从黑红色至浅红均有出现,N. repanda次之,N. rustica的所有花粉均呈浅红色. 从观测效果来看,初步认为FDA-PI染色法和TTC染色法检测烟草花粉活力可行性较高.

    • 不同检测方法测定花粉活力的结果如表2所示. 根据实验室前期相关研究工作,使用含最适蔗糖和硼酸浓度的培养基检测3个烟草种花粉离体萌发活力. 萌发率统计结果显示:3个种的花粉萌发率均大于60%,其中以N. rustica总体活力最高,达66.82%;栽培品种K326次之,接近64%(63.91%); N. repanda的花粉活力为62.57%. 在显微镜下,从花粉粒形态角度来看,萌发的花粉颗粒大且饱满,而未萌发的花粉多数颗粒偏小或形状不规则,因此可以认为本实验中离体萌发结果比较符合花粉的真实萌发力,可以准确直观地反映烟草花粉活力状况.

      检测方法K326N. repandaN. rustica
      离体萌发法 63.91 62.57 66.82
      FDA-PI荧光染色法 43.64 20.67 19.21
      TTC染色法 60.66 59.16 78.98

      表 2  不同方法检测烟草花粉活力统计结果

      Table 2.  Statistical results of different methods for detecting the pollen viability of Nicotiana %

      经FDA-PI和TTC两种方法染色后,有活力花粉与无活力花粉在显微镜下可以观察到明显的色差,可以进行着色率统计和花粉活力计算.

      FDA-PI染色结果显示的花粉活力极低,K326、N. repandaN. rustica 3个种花粉活力依次为43.64%、20.67%、19.21%,与离体萌发结果相比,测得的花粉活力明显偏低. 该方法虽然操作简便,染色后颜色区分度极其明显,但其反映出的花粉总体活力与实际状况相差甚远,因此该方法不适用于烟草花粉活力的检测.

      TTC染色法测定的花粉活力略高,K326为60.66%、N. repanda为59.16%,N. rustica为78.98%. K326和N. repanda的测定结果与上述离体萌发结果相一致,而N. rustica的花粉活力测定值略偏高. 从染色定性角度来看,深红色花粉活力较强,颜色随花粉活力的减弱而变浅,无活力花粉则不着色. 该方法可以一定程度上反映花粉粒个体活力强弱和花粉的总体活力. 综合比较认为TTC染色法可以用于烟草花粉活力的快速检测.

      用I2-KI染色法和联苯胺染色法测定花粉活力时,按照上述统计方法,从染色定性的角度来看,I2-KI染色后的花粉呈黄褐色或褐黑色,这与有活力的花粉被染成蓝色不符,并且几乎所有花粉均着色;与此类似,联苯胺染色法染色后所有花粉均着色. 若仅以着色率表示花粉活力,则这两种方法测得的花粉活力接近100%,这与离体萌发实际状况不符,因此这两种方法都不适用于烟草花粉活力的检测.

    • 本研究结果表明,用离体萌发法检测烟草花粉活力,结果直观,准确,能够反映花粉的真实活力状况. 与萌发法相比,TTC染色法操作更简便,着色效果良好,该方法可以用于烟草花粉活力的快速检测. FDA-PI染色法、I-KI染色法和联苯胺染色法则不适用于烟草花粉活力的检测.

      利用染色法进行植物花粉生活力测定具有快速简便的优点,但是受花粉自身特性,如花粉细胞壁的厚薄、花粉粒外壁的成分、花粉内各种酶活性的强弱等的影响较大[19],因此各种染色方法的适用性必须经过针对性的实验探究,方可作出判断. 与此同时,各种测定花粉生活力的染色方法,直接反映了花粉的代谢情况或营养物质含量,但是不能直接反映出花粉的萌发率. 因此,只有当各种方法所测定的结果与离体萌发相一致时,才可以选用[20]. 另外,染色法测定花粉活力时,关于着色深浅与活力有无对应关系的界定,没有一个严格的量化标准,在观察统计时容易受到研究者主观因素的影响而导致结果偏差.

      在本研究中,FDA-PI染色法结果色差极其明显,但是有些花粉颗粒大而饱满依然显示亮红色荧光(无活力),这与花粉活力实际状况不符. 分析认为,进入衰老期但尚未凋亡或死亡的花粉细胞,其细胞膜也可能出现轻微缺损,这样的花粉也会被染成红色. 另外,通过染色结果可以观察到有些花粉粒虽然呈现亮绿色荧光,但其外围有隐约可见的红色荧光,而有些花粉粒主要呈暗红色,但中心有微弱的绿色荧光,这可能是由于植物细胞在蓝色激发光下存在红色自发荧光,因而活力较弱的花粉呈现出暗红色. 由此,上述原因都会导致花粉活力测定结果偏低.

      利用TTC染色法检测烟草花粉活力时,虽然具有良好的染色效果,但其结果仍然与离体萌发结果不完全一致. 分析认为,活力弱或发育畸形的花粉因其呼吸作用弱而产生极少或不产生脱氢酶,这样的花粉着色极浅,而完全丧失活力的花粉不着色,浅色与无色之间无绝对界限,判断受主观因素影响,统计的结果可能出现比萌发率偏高或偏低的情况.

      I2-KI染色原理简单,操作简便,但是该方法是根据花粉内淀粉染色情况来判断花粉活力的,所以即使花粉已经失去活力,而淀粉尚未被水解,这样花粉依然会着色. 相反,对于有些淀粉含量原本就低的物种或品种而言,花粉的着色情况与花粉活力并无相关性. 同时,该方法的染色结果还受花粉细胞壁的厚薄和花粉中直链淀粉和支链淀粉比例高低的影响[21]. 直链淀粉遇碘显深蓝色,而支链淀粉遇碘显紫色[22]. 在本研究中,经I2-KI染色后,观察到烟草花粉呈黄褐色(K326、N. repandaN. rustica)和褐黑色(N. repanda),这与有活力花粉显蓝色不符. 分析认为,出现该结果的原因可能是:K326和N.rustica中的淀粉含量低,因而无蓝色或紫色花粉,花粉呈现出与染液相近的颜色. N.repanda中淀粉含量比另外两个种质中的稍高,染液本身的颜色与蓝色或紫色叠加而使花粉呈现褐黑色.

      联苯胺染色法即过氧化物酶染色法,通过花粉细胞中过氧化物酶的活性来反映花粉的活力. 在本研究中,我们观察到经联苯胺染液染色后,3个烟草种的花粉均着色. 马志民等指出过氧化物酶染色法受花粉发育成熟程度影响较大,不能鉴别未成熟、败育和衰老的花粉,容易导致检测结果偏高[23].

      总之,花粉活力的测定没有普遍适用的方法,在进行不同物种或不同品种的植物花粉活力检测时,必须通过实践对各种方法进行检验和分析比较,结合研究工作的需要,选用科学,准确,简便的方法. 同时,为了实现植物花粉生活力测定的科学化和规范化,除了探究新的测定方法外,还需要针对现有的方法,建立一系列公认的判定标准,例如I2-KI染色后花粉活力有无与颜色种类的对应关系,TTC染色后浅色与无色的界定. 各种染色法的着色率受染色时间、染色温度、花粉成熟程度、花粉细胞壁厚薄等因素的影响,各染色法中浅色花粉实际活力的有无等,这些问题都有待深入探讨.

参考文献 (23)

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