基于SSR分子标记‘云茄3号’的种子纯度鉴定

蔚亚楠 龚亚菊 汪骞 黎志彬 鲍锐 李石开 吴丽艳

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基于SSR分子标记‘云茄3号’的种子纯度鉴定

    作者简介: 蔚亚楠(1997−),女,山东人,主要从事分子标记研究;
    通讯作者: 吴丽艳, wuliyan_123@sohu.com

Seed purity identification of eggplant cultivar ‘Yunqie No.3’ based on SSR molecular marker

    Corresponding author: WU Li-yan, wuliyan_123@sohu.com
  • 摘要: 为给云南省自育茄子品种‘云茄3号’的制种和大面积推广应用提供技术支持,研究利用SSR分子标记技术对‘云茄3号’的亲本(母本E26×父本E268)进行特异引物筛选,并将筛选出的呈共显性的多态性引物在市场常见茄子品种中进行复筛,应用最终筛选出的标记引物对‘云茄3号’单株进行纯度鉴定,对比田间植株纯度检测结果,验证SSR分子标记种子纯度鉴定的有效性. 研究结果表明,从66对已报道的备筛SSR引物中,筛选出2对引物(SM17和SM29)在亲本中呈互补带型的多态性引物,2对引物均能清晰地将‘云茄3号’与其它6个茄子杂交品种区分开来. 纯度鉴定结果显示,SSR分子标记检测与田间植株纯度鉴定结果一致,均达到了99%. 以上结果表明,在检测种子纯度方面,SSR分子标记与传统的田间种植观察相比有着简单、高效的特点,可作为分子标记辅助手段,加快茄子优良品种的选育和推广.
  • 图 1  茄子基因组DNA条带

    Figure 1.  DNA bands of eggplant genome

    图 2  ‘云茄3号’及其亲本SSR谱带类型比较

    Figure 2.  Comparison on SSR band types between ‘Yunqie No.3’ and its parents

    图 3  引物SM17和SM29在7个紫长茄杂交品种中的扩增表现

    Figure 3.  The SSR amplification results of primer SM17 and primer SM29 in 7 eggplant cultivars

    图 4  引物SM17对茄子杂交种‘云茄3号’群体纯度鉴定的SSR部分扩增结果

    Figure 4.  The partial SSR amplification results of primer SM17 for purity identification in ‘Yunqie No.3’ hybrid population

    图 5  引物SM29对茄子杂交种‘云茄3号’群体纯度鉴定的SSR部分扩增结果

    Figure 5.  The partial SSR amplification results of primer SM29 for purity identification in ‘Yunqie No.3’ hybrid population

    图 6  茄子杂交种‘云茄3号’田间调查结果

    Figure 6.  Field properties investigation for ‘Yunqie No.3’ hybrid

    表 1  SSR多态性引物序列

    Table 1.  The primer sequences of polymorphic SSR

    引物名称正向引物序列(5′-3′)反向引物序列(5′-3′)
    SM17ATCAATGACACCCAAAACCCATTTGTTTGAAAACCCAATACAAATCCGA
    SM29ATTGTGTCGATGAGATTTTGGTCAGTTTAGCTACGTTGGTTTGGTGCTGAA
    SSR174ATTGGTGAACGATGATCCTGAATGGTTTAGAGAATGGGATGAGATTGCTTCG
    SSR199ATCAAATGGGAGAAAATACTGCATCGTTTGGCTTAAACACACAACGTATATGGAC
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  • [1] 李植良, 黎振兴, 黄智文, 等. 我国茄子生产和育种现状及今后育种研究对策[J]. 广东农业科学, 2006(1): 24-26. DOI:  10.16768/j.issn.1004-874x.2006.01.008.
    [2] 连勇, 刘富中, 陈钰辉. 我国茄子地方品种类型分布及种质资源研究进展[J]. 中国蔬菜, 2006(10): 9-14. Lian Y, Liu F Z, Chen Y H, et al. Chinese eggplant cultivars (Solanum melongena L.) distribution and germplasm resources research advancement[J]. China Vegetables, 2006(10): 9-14.
    [3] 龚亚菊, 吴丽艳, 黎志彬, 等. 茄子新品种云茄3号的选育[J]. 中国蔬菜, 2012(22): 103-104. Gong Y J, Wu L Y, Li Z B, et al. A new eggplant F1 hybrid - ‘Yunqie No. 3’[J]. China Vegetables, 2012(22): 103-104.
    [4] 王芳. 种子纯度鉴定方法及其评述[J]. 中国种业, 2008(10): 62-63. DOI:  10.19462/j.cnki.1671-895x.2008.10.034.
    [5] 刘军, 周晓慧, 庄勇. 茄子杂交品种种子纯度的SSR分子标记鉴定[J]. 分子植物育种, 2013, 11(6): 790-794. DOI:  10.3969/mpb.011.000790. Liu J, Zhou X H, Zhuang Y. Application of SSR markers to the identification of seed purity of eggplant hybrids[J]. Molecular Plant Breeding, 2013, 11(6): 790-794.
    [6] 郭竞, 赵香梅, 别志伟, 等. 我国茄子生产选择品种的原则[J]. 农业科技通讯, 2014(8): 267-268. GUO J,ZHAO X M,BIE Z W,et.al. The principres of selecting variteties for eggplant production in china[J]. Bulletin of Agricultural Science and Technologg, 2014(8): 267-268.
    [7] 徐明新, 戴延安. 种子纯度检验技术[J]. 现代农业科技, 2008(18): 213. XU M X,DAI Y A. The inspection technologies for seed purity[J]. Moder Agricultural Science and Technology, 2008(18): 213.
    [8] 罗文永, 胡骏, 李晓方. 微卫星序列及其应用[J]. 遗传, 2003, 25(5): 615-619. DOI:  10.16288/j.yczz.2003.05.027. Luo W Y, Hu J, Li X F. The evolution and application of microsatellites[J]. Hereditas, 2003, 25(5): 615-619.
    [9] 李素玲, 张君捷, 柴美清, 等. 应用SSR标记技术鉴定玉米杂交种的纯度[J]. 山西农业科学, 2007, 35(1): 36-38. Li S L, Zhang J J, Chai M Q, et al. Application of SSR marker technique to purity testing of maize[J]. Journal of Shanxi Agricultural Sciences, 2007, 35(1): 36-38.
    [10] Liu L W, Wang Y, Gong Y Q, et al. Assessment of genetic purity of tomato (Lycopersicon esculentum L.) hybrid using molecular markers[J]. Scientia Horticulturae, 2007, 115(1): 7-12. DOI:  10.1016/j.scienta.2007.07.013.
    [11] Liu L, Li J, Liu P, et al. A genetic linkage map of swimming crab (Portunus trituberculatus) based on SSR and AFLP markers[J]. Aquaculture, 2012, 344: 66-81. DOI:  10.1016/j.aquaculture.2012.01.034.
    [12] Verma M, Rathi S, Munshi A D, et al. Genetic diversity of Indian brinjal revealed by RAPD and SSR markers[J]. Indian Journal of Horticulture, 2012, 69(4): 517-522.
    [13] 周贤达, 王凤辰, 周桂林, 等. 西瓜杂交种纯度SSR分子鉴定技术研究[J]. 中国瓜菜, 2012, 25(5): 13-16. DOI:  10.16861/j.cnki.zggc.2012.05.003. Zhou X D, Wang F C, Zhou G L, et al. Testing of genetic purity of watermelon F1 varieties by SSR markers[J]. China Cucurbits and Vegetables, 2012, 25(5): 13-16.
    [14] 李怀志. 茄子遗传连锁图谱构建及果实相关性状QTL定位[D]. 上海: 上海交通大学, 2011.

    Li H Z. Construction of genetic linkage map and QTL mapping of fruit related traits in eggplant (Solanum melongena L.)[D]. Shanghai: Shanghai Jiao Tong University, 2011
    [15] 王利英, 乔军, 石瑶, 等. 茄子SSR多态性引物的筛选及品种纯度鉴定[J]. 华北农学报, 2012, 27(4): 98-101. Wang L Y, Qiao J, Shi Y, et al. Selection of SSR core primers and varietals purity identification in eggplant[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2012, 27(4): 98-101.
    [16] 张敏, 谈太明, 徐长城, 等. SSR分子标记技术在茄子杂交种子纯度鉴定中的应用[J]. 湖北农业科学, 2013, 52(8): 1 959-1 962. DOI:  10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2013.08.058. Zhang M, Tan T M, Xu C C, et al. Application of SSR molecular markers technique in purity identification of Solanum melongena hybrid seed[J]. Hubei Agricultural Sciences, 2013, 52(8): 1 959-1 962.
    [17] 冯英娜. 茄子遗传多样性与主要农艺性状标记关联分析[D]. 南京: 南京农业大学, 2014.

    Feng Y N. Genetic diversity and association analysis with agronomic traits in eggplant (Solanum melongena L.) with SSR marker[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2014.
    [18] 张洪源, 谈杰, 张敏, 等. 茄子SSR多态性标记筛选及杂交种纯度鉴定[J]. 南方农业学报, 2017, 48(7): 1 148-1 154. DOI:  10.3969/j.issn.2095-1191.2017.07.03. Zhang H yuan, Tan J, Zhang M, et al. Screening of polymorphic SSR markers and hybrid seed purity identification of Solanum melongena L.[J]. Journal of Southern Agriculture, 2017, 48(7): 1 148-1 154.
    [19] Demir K, Bakir M, Sarikamis G, et al. Genetic diversity of eggplant (Solanum melongena) germplasm from Turkey assessed by SSR and RAPD markers[J]. Genetics and Molecular Research, 2010, 9(3): 1 568-1 576. DOI:  10.4238/vol9-3gmr878.
    [20] Barchi L, Lanteri S, Portis E, et al. Identification of SNP and SSR markers in eggplant using RAD tag sequencing[J]. BMC Genomics, 2011, 12(1): 304. DOI:  10.1186/1471-2164-12-304.
    [21] Ge H, Liu Y, Jiang M, et al. Analysis of genetic diversity and structure of eggplant populations (Solanum melongena L.) in China using simple sequence repeat markers[J]. Scientia Horticulturae, 2013, 162: 71-75. DOI:  10.1016/j.scienta.2013.08.004.
    [22] Kumar A, Dadlani M, Kumar R, et al. Identification and validation of informative SSR markers suitable for ensuring the genetic purity of brinjal (Solanum melongena L.) hybrid seeds[J]. Scientia Horticulturae, 2014, 171: 95-100. DOI:  10.1016/j.scienta.2014.03.034.
    [23] 潜宗伟, 陈海丽, 崔彦玲. 茄子种子纯度SSR标记快速鉴定[J]. 北方园艺, 2014(23): 75-78. Qian Z W, Chen H L, Cui Y L. Rapid hybrid purity identification of eggplant by SSR markers[J]. Northern Horticulture, 2014(23): 75-78.
    [24] 王艳娜, 王益奎, 李文嘉, 等. 利用SSR分子标记技术鉴定和分析茄子杂种F1的纯度[J]. 南方农业学报, 2015, 46(9): 1 551-1 556. DOI:  10.3969/j:issn.2095-1191.2015.09.1551. Wang Y N, Wang Y K, Li W J, et al. Identification and analysis on F1 hybrid purity of eggplant by using SSR molecular marker technology[J]. Journal of Southern Agriculture, 2015, 46(9): 1 551-1 556.
    [25] Li D, Qian J, Li W, et al. Genome sequence and analysis of the eggplant (Solanum melongena L.)[J]. bioRxiv, 2019: 824540.
  • [1] 吴丽艳杜光辉鲍锐黎志彬龚亚菊 . 茄子种质资源的农艺性状与SSR标记的遗传多样性研究. 云南大学学报(自然科学版), doi: 10.7540/j.ynu.20170585
    [2] 赵元蛟苏文华周睿张光飞白雪 . 壳斗科栲属种子结构性防御与化学防御的权衡. 云南大学学报(自然科学版), doi: 10.7540/j.ynu.20120470
    [3] 王兵益苏建荣张志钧束传林尹德平 . 云南红豆杉小孢子叶球和种子的时空分布规律. 云南大学学报(自然科学版),
    [4] 徐涛王跃华蒋连计 . 厚皮香植物的种子特性与扦插繁殖的初步研究. 云南大学学报(自然科学版),
    [5] 姚启伦杨克诚潘光堂荣廷昭 . 云南和贵州玉米地方品种遗传多样性的比较分析. 云南大学学报(自然科学版),
    [6] 郭仕坛伍建榕胡隽杨宏光陆露刘芳 . 大雪兰种子的共生培养研究. 云南大学学报(自然科学版),
    [7] 蔡年辉张瑞丽许玉兰魏巍段安安李悦 . 高山松不同居群种子萌发及其分化研究. 云南大学学报(自然科学版), doi: 10.7540/j.ynu.20120417
    [8] 陈美卿王崇云张宗魁王帅任鹏 . 云南油杉种子散布的生态适应特征研究. 云南大学学报(自然科学版),
    [9] 范妮薛伟明 . 壳聚糖荧光标记反应研究. 云南大学学报(自然科学版),
    [10] 陈辉曹敏 . 光温协同影响光敏性先锋草本粽叶芦的种子萌发. 云南大学学报(自然科学版), doi: 10.7540/j.ynu.2013a20
    [11] 曹子林王晓丽张权新李根前 . 紫茎泽兰入侵的云南松林种群结构及其土壤种子库特征. 云南大学学报(自然科学版), doi: 10.7540/j.ynu.20160039
    [12] 刘文胜齐丹卉李世友朱明远苏焕珍 . 兰坪铅锌矿区植被恢复初期土壤种子库的研究. 云南大学学报(自然科学版), doi: 10.7540/j.ynu.20120710
    [13] 陈发军陈坤浩沈有信 . 黔西北喀斯特生境中主要植物的繁殖物候及种子生产. 云南大学学报(自然科学版),
    [14] 冯秀彦王跃华潘跃芝 . 濒危植物单羽苏铁SSR引物的筛选. 云南大学学报(自然科学版),
    [15] 蔡年辉许玉兰徐杨邓丽丽周丽王大玮何承忠段安安 . 云南松转录组SSR的分布及其序列特征. 云南大学学报(自然科学版), doi: 10.7540/j.ynu.20150206
    [16] 刘飞虎Nancy Longnecker . 增施钾肥和末期干旱对白羽扇豆结荚和种子产量的影响. 云南大学学报(自然科学版),
    [17] 王晓丽曹子林朱霞 . 紫茎泽兰不同处理方法水提液对蓝桉种子发芽的化感效应. 云南大学学报(自然科学版),
    [18] 彭晓昶潘燕朱晓媛周新茂高杰王崇云 . 云南7种常见菊科杂草植物具冠毛种子形态与风传播特征*. 云南大学学报(自然科学版), doi: 10.7540/j.ynu.20180027
    [19] 李光菊李璇王倩张亚娟卜秋力杜光辉刘飞虎 . 不同外源物质浸种对干旱胁迫下巴马火麻种子萌发的影响研究*. 云南大学学报(自然科学版), doi: 10.7540/j.ynu.20170615
    [20] 陈义光刘祝祥李铭刚文孟良郭端强徐丽华 . 产环己酰亚胺新菌株YIM41004种子培养基优化研究初报. 云南大学学报(自然科学版),
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-01-13
  • 录用日期:  2020-05-11
  • 网络出版日期:  2020-06-22

基于SSR分子标记‘云茄3号’的种子纯度鉴定

    作者简介:蔚亚楠(1997−),女,山东人,主要从事分子标记研究
    通讯作者: 吴丽艳, wuliyan_123@sohu.com
  • 1. 云南省农业科学院 园艺作物研究所,云南 昆明 650205
  • 2. 云南农业大学 农学与生物技术学院,云南 昆明 650201
  • 3. 云南省蔬菜种质创新与配套产业技术工程研究中心,云南 昆明 650205

摘要: 为给云南省自育茄子品种‘云茄3号’的制种和大面积推广应用提供技术支持,研究利用SSR分子标记技术对‘云茄3号’的亲本(母本E26×父本E268)进行特异引物筛选,并将筛选出的呈共显性的多态性引物在市场常见茄子品种中进行复筛,应用最终筛选出的标记引物对‘云茄3号’单株进行纯度鉴定,对比田间植株纯度检测结果,验证SSR分子标记种子纯度鉴定的有效性. 研究结果表明,从66对已报道的备筛SSR引物中,筛选出2对引物(SM17和SM29)在亲本中呈互补带型的多态性引物,2对引物均能清晰地将‘云茄3号’与其它6个茄子杂交品种区分开来. 纯度鉴定结果显示,SSR分子标记检测与田间植株纯度鉴定结果一致,均达到了99%. 以上结果表明,在检测种子纯度方面,SSR分子标记与传统的田间种植观察相比有着简单、高效的特点,可作为分子标记辅助手段,加快茄子优良品种的选育和推广.

English Abstract

  • 茄子(Solanum melongena L.)属于茄科(Solanaceae)茄属(2n=24),原产于东南亚、印度,早在公元4—5世纪就传入中国. 至今,我国已成为茄子种植面积最大,也是茄子种质资源保存最多的国家[1-2]. 近年来,茄子已成为我国主要蔬菜种类之一,在生产中占有重要地位.

    云南省茄子种植面积一直保持在1.67万hm2 (25.0万亩)左右. 除滇中、滇东北等大多数地区进行春夏栽培外,元谋、元江、宾川、华宁、开远、西双版纳等气候温暖的低海拔河谷地区还可进行冬春错季栽培,销往省内外,成为外销冬春早熟蔬菜的一大种类. 然而,由于各地消费习惯和生态气候不同,茄子外引品种在云南栽培后往往不能适应云南低纬度高海拔气候,从而不能表现出原有的优良性状或外观品质,不被当地消费者所接受. ‘云茄3号’由云南省农业科学院园艺作物研究所培育而成,该品种果实长条形,果长约34 cm,横径约5.3 cm. 果皮鲜紫色,有光泽,皮薄,果肉乳白色,肉质较松软,单果质量约330 g,每亩产量5500 kg左右. ‘云茄3号’具有长势强、果形好、品质优、丰产性好、较抗病等优良的综合性状,是云南省具有自主知识产权,适宜本地栽培的仅有的几个茄子新品种之一[3].

    品种纯度是种子的主要质量指标之一,影响作物的产量和品质;由于纯度低而导致的减产会在一定程度上削弱一个新品种的潜力,从而造成巨大的经济损失,因此,种子纯度的鉴定在品种选育研究方面至关重要[4]. 然而,当前制约我国茄子产业经济效益提高的关键问题之一就是选种问题,存在品种杂乱,常规种与杂交种混杂,外引种和地方品种并存,种子纯度低且品质良莠不齐等问题,严重影响了农民收入,制约了茄子产业的可持续发展[5-6].

    目前,常用的种子纯度鉴定方法有形态检验法、蛋白质电泳技术检验法、DNA分子标记技术检验法等. 其中,DNA分子标记技术检测对象是种子的DNA片段,不受环境影响,有较高的准确性、稳定性和重复性而应用广泛[7]. 简单重复序列标记(simple sequence repeats, SSR)是一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术,也称为微卫星DNA,是一类由几个核苷酸(一般为1~6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列. 与其它分子标记相比,SSR分子标记具有以下优势:①大量、随机地分布于整个基因组,多态性高;②呈孟德尔方式遗传,共显性,不易被自然选择和人工选择所淘汰;③仅需少量DNA即可进行PCR扩增,其产物通过电泳分析,操作简便、分辨率高,PCR扩增的可重复性高;④在种属间有良好的通用性;⑤SSR位点由设计的引物顺序决定,便于相互交流,开发新引物;⑥一旦确定引物,结果稳定等. 因此,SSR分子标记技术已成为品种鉴定、申请和保护过程中研究应用的热点[8-13].

    基于此,为了给茄子优良品种‘云茄3号’提供一种高效、快速的种子纯度鉴定方法,加快其制种和推广应用速度,本研究通过已知SSR引物,筛选出在亲本中呈互补带型的多态性引物,再在市场常见的茄子杂交品种中进行复筛,利用最终筛选出的引物对‘云茄3号’进行纯度鉴定;同时,结合田间观察结果进行准确度判断. 本研究结果有助于保护茄子品种,加快优良品种的选育和推广,并为以后的茄子育种研究奠定技术参考.

    • 试验材料‘云茄3号’及其父母本E26×E268(资源编号),均为紫长茄类型,由云南省农业科学院园艺作物研究所提供. 6个昆明市场主要杂交茄子品种,‘火金刚’、‘长丰2号’、‘昆明紫长茄’、‘长丰3号’、‘红秀’、‘云茄6号’,属紫长茄类型,购自云南省昆明市小板桥种子交易市场,均为目前市场上主要种植的紫长茄杂交茄子品种.

      以上茄子材料均在2019年3月种植于云南省农业科学院嵩明基地,待幼苗有4~6片真叶时,随机选‘云茄3号’100株,其它材料各20株,取叶片依次编号后–80 ℃保存备用. 用于田间鉴定的茄子材料对应前面DNA编号进行编号,挂牌后种植于大田中进行常规管理.

      备筛的66对SSR引物选自李怀志、王利英等人[14-18]公开发表的SSR标记引物.

    • 茄子基因组DNA的制备使用DNA提取纯化试剂盒(康宁生命科学(吴江)有限公司),按照相应说明书进行提取;应用NanoDrop2000超微量核酸蛋白分析仪对DNA样品进行浓度和纯度检测.

    • 通过温度梯度PCR设置不同退火温度,对不同引物的适宜退火温度进行摸索,根据摸索结果将66对引物分为4个退火温度(55、58、61、63 ℃)类型,按以下反应体系和程序,在BIO-RAD thermal cycle PCR仪上进行扩增.

      SSR-PCR反应体系(20 μL):10 µL 2 × Taq Plus Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司),DNA模板1 µL,正反引物各1 µL,7 µL ddH2O.

      扩增程序:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,55 ℃/58 ℃/61 ℃/63 ℃退火40 s;72 ℃延伸85 s,30次循环;72 ℃延伸5 min,4 ℃保存.

    • 将扩增产物应用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶在双向垂直电泳槽(北京六一)上180 V电泳90 min;每孔点样2 μL,DNA Marker使用50 bp plus DNA Ladder(北京酷来搏科技有限公司). 电泳结束后,将胶块轻轻取下后在固定液(0.02%冰醋酸和99%酒精混合液)中浸泡10 min,取出后,ddH2O冲洗1次,再在0.1% AgNO3溶液中银染10 min,取出后,再用ddH2O快速冲洗2次,随后浸泡于显影液(3% NaOH和0.5%甲醛混合液)中显影,至可以观察到DNA条带后立即用ddH2O漂洗,平铺在观察灯上观察、拍照并编号保存.

    • 应用66对备筛引物,对‘云茄3号’及其父母本进行特异条带筛选. 根据电泳结果,筛选出条带清晰、多态性好的共显性标记,用于后续市场常见茄子品种检测和杂交种‘云茄3号’的纯度鉴定.

    • 将筛选出的共显性引物对目前市场常见的杂交茄品种进行电泳,从中筛选出能够将‘云茄3号’与其它品种区分开的特异性引物,用于下一步的纯度鉴定中.

    • 将筛选出的多态性好且能够将‘云茄3号’与其它常见品种区分开的共显性标记引物在‘云茄3号’的100个单株里进行检测,并拍照、记录.

    • 将大田中与DNA编号一致的100株‘云茄3号’单株,在盛果期进行性状调查,通过比较株型、叶型、果型、果色、萼片色等表型性状对群体进行纯度鉴定,并与SSR纯度鉴定结果进行对比.

    • 提取的茄子基因组DNA, 经0.8% 琼脂糖电泳检测,可见条带清晰 ,无拖带(图1).DNA检测结果显示,A260/A280值介于1.8~2.0之间,表明提取的DNA质量较好,符合以后试验的要求;DNA质量浓度介于50~100 ng/µL之间,统一稀释至50 ng/µL.

      图  1  茄子基因组DNA条带

      Figure 1.  DNA bands of eggplant genome

    • 将查阅文献所得的66对备选引物在适宜的退火温度下扩增亲本条带,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,寻找到4对扩增条带清晰的多态性引物(表1). 再将父母本与杂交种同时在4对多态性引物扩增下检测,确定出了2对在杂交茄‘云茄3号’及其亲本中多态性条带清晰、稳定性好的引物SM17和SM29(图2).

      引物名称正向引物序列(5′-3′)反向引物序列(5′-3′)
      SM17ATCAATGACACCCAAAACCCATTTGTTTGAAAACCCAATACAAATCCGA
      SM29ATTGTGTCGATGAGATTTTGGTCAGTTTAGCTACGTTGGTTTGGTGCTGAA
      SSR174ATTGGTGAACGATGATCCTGAATGGTTTAGAGAATGGGATGAGATTGCTTCG
      SSR199ATCAAATGGGAGAAAATACTGCATCGTTTGGCTTAAACACACAACGTATATGGAC

      表 1  SSR多态性引物序列

      Table 1.  The primer sequences of polymorphic SSR

      图  2  ‘云茄3号’及其亲本SSR谱带类型比较

      Figure 2.  Comparison on SSR band types between ‘Yunqie No.3’ and its parents

      应用这2对引物对市场上常见的6个紫长茄杂交种中进行检测,结果表明,SM17和SM29均可将‘云茄3号’与其它品种区分开来,可以用于下一步‘云茄3号’的纯度检测(图3).

      图  3  引物SM17和SM29在7个紫长茄杂交品种中的扩增表现

      Figure 3.  The SSR amplification results of primer SM17 and primer SM29 in 7 eggplant cultivars

    • 通过提取‘云茄3号’单株的DNA,共获得100份样品并依次编号. 将筛选出的两对在亲本中呈共显性条带的引物SM17和SM29,分别对上述100份样品进行纯度检测,结果如图45所示. 引物SM17检测结果(图4)显示,在100份样品中,36号单株表现为母本型条带,其它条带为杂合型,表明该单株为偏母本的杂株,剩下99株为纯合F1代,引物SM17检测出的‘云茄3号’种子纯度为99%. 引物SM29扩增产物检测结果(图5)表明,100份样品中的同样编号出现了1个母本型条带,其它条带则完全一致,表明引物SM29检测出的‘云茄3号’种子纯度与引物SM17检测结果一致,纯度也为99%.

      图  4  引物SM17对茄子杂交种‘云茄3号’群体纯度鉴定的SSR部分扩增结果

      Figure 4.  The partial SSR amplification results of primer SM17 for purity identification in ‘Yunqie No.3’ hybrid population

      图  5  引物SM29对茄子杂交种‘云茄3号’群体纯度鉴定的SSR部分扩增结果

      Figure 5.  The partial SSR amplification results of primer SM29 for purity identification in ‘Yunqie No.3’ hybrid population

    • 在大田中种植的20株父母本与100株‘云茄3号’(图6)均存活. 当茄子盛果期时统一进行性状调查,通过比较株型、叶型、果型、果色、萼片色等表型性状对群体进行纯度鉴定. 检测出偏母本的杂株1株,且编号与DNA样品一致均为36号. 因此,其田间纯度检测结果为99%. 这与SSR分子标记技术检测的结果一致,说明SSR技术能够用于茄子F1代种子纯度的快速检测.

      图  6  茄子杂交种‘云茄3号’田间调查结果

      Figure 6.  Field properties investigation for ‘Yunqie No.3’ hybrid

    • SSR分子标记在茄子中的应用,国内外均有报道[19-22]. 然而,由于茄子远缘杂交不亲和,几乎所有的商业品种都由栽培茄自交系配组而成,从而使得栽培种之间的亲缘关系普遍较近,很难找到在双亲中存在差异且在杂一代中呈现共显性的SSR标记. 张敏等[16]利用SSR技术对‘鄂茄子2号’的杂种一代群体进行纯度鉴定,从100对引物中筛选出了3对特异性引物;王利英等[15]用已有的236对SSR引物对3个茄子品种进行多态性标记分析,仅筛选出15对多态性引物用于3个品种的纯度鉴定;潜宗伟等[23]为了鉴定茄子杂交种‘京茄218’的纯度,从152对SSR引物中筛选出2对引物的扩增条带在‘京茄218’中呈现父母本互补带型;王艳娜等[24]在124对SSR引物中筛选出15对多态性引物来鉴定茄子杂种F1纯度. 然而,目前筛选出的茄子SSR多态性引物与其它作物相比仍较少,且不同品种的多态标记也会随之不同,因此,针对‘云茄3号’有必要重新进行SSR标记的筛选.

      本研究从已发表的文献中筛选出66对SSR引物,将其应用于‘云茄3号’和父母本材料进行多样性引物筛选,筛选出4对多态性引物,多态性引物的比例为6.06%. 最终,从中仅筛选出2对条带清晰、稳定性好、呈互补带型的SSR引物,可见其利用率相当低. 此外,父母本之间的差异条带大部分不位于条带清晰的主条带,而在副条带(大小为200~300 bp)不容易观察,由此可见茄子种子纯度鉴定中SSR引物筛选的难度比较高. 通过检测,筛选出的2对共显性引物(SM17和SM29)均可将‘云茄3号’与其它品种区分开来,表明其为有效引物. SM17和SM29对‘云茄3号’的100个单株进行纯度检测,两者检测结果一致且与田间调查结果相吻合,杂交种‘云茄3号’的纯度为99%,且发现群体中唯一的1株杂株为母本混杂引起的,可能是由于人为操作,如人工去雄不彻底或母本种子混入造成.

      以上表明,引物SM17和SM29可用于茄子杂交种‘云茄3号’的种子纯度SSR分子鉴定,并验证了SSR技术应用于种子纯度鉴定的高效、快速、准确等优点. 然而,此技术前期合成新的SSR引物费时耗力,并且成本高,使得SSR技术在实际运用中受到了一定的限制[15]. 不过,随着茄子基因组的不断完善[25]和研究者的不断挖掘,更多的SSR位点将被标记出来,进而开发成本也会降低. 新的分子标记技术也在不断涌现,分子标记辅助育种在茄子新品种选育和保护上的应用将更加广泛.

参考文献 (25)

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