结核分枝杆菌新型亚单位疫苗的初步研究

时宇 陶玉芬 刘建生 刘红旗

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结核分枝杆菌新型亚单位疫苗的初步研究

    作者简介: 时宇(1994−),女,吉林人,硕士生,主要从事结核新型疫苗方面的研究;
    通讯作者: 刘红旗, lhq@Imbcams.com.cn
  • 中图分类号: R378.911

Preliminary study on a novel subunit vaccine of Mycobacterium tuberculosis

    Corresponding author: LIU Hong-qi, lhq@Imbcams.com.cn
  • CLC number: R378.911

  • 摘要: 为了研发结核新型亚单位疫苗,以纳米颗粒为载体展示结核分枝杆菌主要抗原ESAT6. 将ESAT6基因片段克隆到位于pGEX-4T-1载体上的诺如病毒P结构域的Loop2中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,用GST亲和柱纯化,并通过FPLC分析嵌合纳米颗粒的形成效率,最后免疫BALB/c小鼠进行免疫原性的评价. 结果表明:研究成功地将ESAT6基因克隆至诺如病毒P结构域的Loop2中,且空间结构模拟提示ESAT6能展示在P纳米颗粒的表面. FPLC分析表明,表达的嵌合蛋白可以高效地自我组装成纳米颗粒. 用该嵌合颗粒免疫小鼠后,能诱导产生针对ESAT6重组嵌合颗粒的特异性抗体. 进一步分析发现,诱导的抗体主要针对ESAT6的51~70肽段,而不是1~20肽段. 综上,研究通过诺如病毒P颗粒成功地展示了结核分枝杆菌主要抗原ESAT6,为进一步研发结核新型亚单位疫苗奠定了基础.
  • 图 1  pGEX4T1-VA387-P和pWSV- H37RvESAT6HL质粒图谱

    Figure 1.  Plasmid maps of pGEX4T1-VA387-P and pWSV- H37RvESAT6HL

    图 2  重组质粒的构建和鉴定

    Figure 2.  Construction and identification of recombinant plasmid

    图 3  P结构域-ESAT6嵌合蛋白空间结构

    Figure 3.  Structure of P domain-ESAT6 chimeric protein

    图 4  表达和纯化后的嵌合蛋白分析

    Figure 4.  Analysis of expressed and purified chimeric protein

    图 5  酶切后嵌合蛋白的FPLC纯化和分析

    Figure 5.  Analysis of purified chimeric protein by FPLC after enzyme digestion

    图 6  免疫小鼠特异性抗体检测

    Figure 6.  Detection of specific antibody in immunized mice

    表 1  ESAT6中和表位氨基酸序列

    Table 1.  Amino acid sequences of ESAT6 neutralizing epitopes

    表位名称长度/aa氨基酸序列
    ESAT-61~2020MTEQQWNFAGIEAAASAIQG
    ESAT-651~7020YQGVQQKWDATATELNNALQ
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    表 2  PCR合成ESAT6的引物序列

    Table 2.  The primer nucleotide sequences of ESAT6 synthesized by PCR

    引物名称引物序列
    F-PrimerCTGTTCAGTACACCACTAGTACTAGTACAG
    R-PrimerCGGTCTGCAGGATATGGCCGCTGCGAACAT
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-03-15
  • 录用日期:  2020-05-11
  • 网络出版日期:  2020-06-23

结核分枝杆菌新型亚单位疫苗的初步研究

    作者简介:时宇(1994−),女,吉林人,硕士生,主要从事结核新型疫苗方面的研究
    通讯作者: 刘红旗, lhq@Imbcams.com.cn
  • 中国医学科学院/北京协和医学院 医学生物学研究所 感染和免疫实验室,云南 昆明 650118

摘要: 为了研发结核新型亚单位疫苗,以纳米颗粒为载体展示结核分枝杆菌主要抗原ESAT6. 将ESAT6基因片段克隆到位于pGEX-4T-1载体上的诺如病毒P结构域的Loop2中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,用GST亲和柱纯化,并通过FPLC分析嵌合纳米颗粒的形成效率,最后免疫BALB/c小鼠进行免疫原性的评价. 结果表明:研究成功地将ESAT6基因克隆至诺如病毒P结构域的Loop2中,且空间结构模拟提示ESAT6能展示在P纳米颗粒的表面. FPLC分析表明,表达的嵌合蛋白可以高效地自我组装成纳米颗粒. 用该嵌合颗粒免疫小鼠后,能诱导产生针对ESAT6重组嵌合颗粒的特异性抗体. 进一步分析发现,诱导的抗体主要针对ESAT6的51~70肽段,而不是1~20肽段. 综上,研究通过诺如病毒P颗粒成功地展示了结核分枝杆菌主要抗原ESAT6,为进一步研发结核新型亚单位疫苗奠定了基础.

English Abstract

  • 结核病(Tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)引起的全球感染率和死亡率最高的疾病[1-3]. 据估计,全球三分之一的人口在感染结核分枝杆菌的潜伏期,这一潜伏期随时可能转变为活动性结核[4-5],对于工业化国家和发展中国家,接种结核疫苗依旧是预防结核病成本最低且有效的方法. 迄今为止,卡介苗仍是唯一可用的结核疫苗[6],可是它在预防成人肺结核方面基本无效[7],而且不能预防结核病的潜伏感染[8-10]. 因此,迫切需要一种有效的结核疫苗来预防结核病. 结核分枝杆菌早期抗原分泌靶6(the 6 kDa early secreted antigenic target produced by Mycobacterium tuberculosis, ESAT6)是活动性结核感染相关的主要抗原. ESAT6是由95个氨基酸构成的低分子量分泌蛋白,它是由大小为288 bp的Rv3875基因编码(Genbank:886209),这些基因位于结核杆菌基因组的RD1中,但是所有卡介苗均缺失了RD1区域[11-12]. ESAT6在毒力中的作用已被实验证实,缺乏ESAT6的卡介苗与RD1互补后,其在不同动物模型中的保护效果显著增强,提示卡介苗的保护不足可能是由于这些主要抗原的缺失所致. 因为ESAT6在结核分枝杆菌毒力和发病机制中发挥重要作用[12-13],所以许多试验旨在开发针对ESAT6的高效结核疫苗[14-15]. 基于ESAT6的亚单位疫苗在动物模型中已显示了巨大的潜力,我们选择ESAT6作为新型结核疫苗的主要抗原. 虽然以ESAT6作为抗原免疫动物能产生有效的中和抗体,但它的分子量相对较小,作为亚单位疫苗的抗原仍面临低免疫原性的问题. 这个问题可以通过将抗原嵌合到一个相对较大、多价的、高免疫原性的亚病毒颗粒上来解决[16].

    研究表明,诺如病毒P结构域(VA387,GI:146387016)由327个氨基酸构成,它单独表达能自发组装成纳米颗粒,且能作为载体呈递外源抗原,是新型疫苗开发的良好平台[16-19]. 因此,本研究尝试通过诺如病毒P颗粒来展示结核分枝杆菌的主要抗原ESAT6,为制备结核新型亚单位疫苗奠定基础.

    • 6周龄雌性BALB/c鼠,由中国医学科学院医学生物学研究所动物中心提供,实验动物生产许可证(SCXK(滇)K2014-002),使用许可证(SYXK(滇)K2014-007),所有动物使用程序都由中国医学科学院医学生物学研究所实验动物伦理委员会审查和批准.

    • 大肠杆菌原核表达质粒pGEX4T1-VA387-P(图1)来自美国辛辛那提儿童医学研究中心谭明博士实验室,质粒骨架为pGEX-4-T-1,包含了GII.4型诺如病毒VA387株的P结构域和GST标签. ESAT6基因根据结核分枝杆菌H37Rv株的ESAT6蛋白的氨基酸序列(Genbank:886209),经密码子优化后通过人工方法合成,委托北京唯尚立德生物科技有限公司完成,保存于质粒pWSV-H37Rv ESAT6HL中. E.coli DH5a和E.coli BL21(DE3)感受态细胞购自昆明硕擎生物科技有限公司.

      图  1  pGEX4T1-VA387-P和pWSV- H37RvESAT6HL质粒图谱

      Figure 1.  Plasmid maps of pGEX4T1-VA387-P and pWSV- H37RvESAT6HL

    • 限制性内切酶SpeⅠ、ClaⅠ购自New England Biolabs;无缝克隆试剂盒购自TAKARA公司;质粒提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司;IPTG购自天根生物技术有限公司;蛋白酶Thrombin,GST融合蛋白预装柱及FPLC纯化柱Hiload 16/600 superdex 200pg购自GE healthcare公司;还原型L-Glutathione及弗氏佐剂购自Sigma-Aldrich公司,GST Rabbit mAb, Anti-mouse IgG及Anti-rabbit IgG购自Cell Signaling Technology公司;Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate购自Thermo公司;TMB LIQUID-1 COMPONENT购自Amresco公司.

    • 根据文献报道,获取ESAT6两个中和表位的氨基酸序列[20],如表1所示,由上海昕浩生物技术有限公司合成.

      表位名称长度/aa氨基酸序列
      ESAT-61~2020MTEQQWNFAGIEAAASAIQG
      ESAT-651~7020YQGVQQKWDATATELNNALQ

      表 1  ESAT6中和表位氨基酸序列

      Table 1.  Amino acid sequences of ESAT6 neutralizing epitopes

    • 根据无缝克隆试剂盒连接指南设计引物,如表2所示,由昆明硕擎生物科技有限公司合成.

      引物名称引物序列
      F-PrimerCTGTTCAGTACACCACTAGTACTAGTACAG
      R-PrimerCGGTCTGCAGGATATGGCCGCTGCGAACAT

      表 2  PCR合成ESAT6的引物序列

      Table 2.  The primer nucleotide sequences of ESAT6 synthesized by PCR

      通过PCR将ESAT6基因从合成的质粒中扩增出来,通过无缝克隆连接到经SpeⅠ和ClaⅠ两个内切酶酶切后的pGEX4T1-VA387-P质粒中,电泳检测后,送昆明硕擎生物科技有限公司测序验证.

    • 基于蛋白质的氨基酸序列,通过在线蛋白质结构预测工具SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/interactive)预测被展示的ESAT6抗原在嵌合纳米颗粒中的位置.

    • 将验证正确的重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,涂布到含氨苄青霉素(50 ng/mL)的LB培养基上,挑取阳性克隆,接种到含氨苄青霉素(50 ng/mL)的LB培养液中,于37 ℃、220 r/min的摇床过夜培养. 次日按1∶50转接,再于37 ℃、220 r/min条件下继续培养至菌液OD600在0.4~0.6之间,加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L,而后12 ℃过夜诱导表达. 收集菌液(12000×g、4 ℃离心10 min),用PBS(pH=7.4)重悬后,冰浴超声破碎,收集上清和沉淀,通过10% SDS-PAGE进行分析.

    • 诱导表达的蛋白以部分可溶性的形式存在,使用GST预装柱(GE)亲和纯化超声上清液,用20 mmol/L还原型谷胱甘肽作为洗脱液,洗脱蛋白,通过10% SDS-PAGE进行分析.

    • 含GST标签的嵌合蛋白经酶切后,通过Hiload 16/600 superdex 200 pg柱(GE)在AKTA纯化系统中,进行FPLC检测,并收集蛋白样品,进行SDS-PAGE和免疫印迹分析.

    • 实验动物雌性BALB/c小鼠共12只,完全随机分组. 免疫抗原(P颗粒、ESAT6与P结构域嵌合颗粒)分别与弗氏佐剂等体积混合乳化后,通过肌肉注射免疫动物(0.3 mg/mL,每只取100 µL蛋白液与等量佐剂乳化,小鼠左右大腿肌肉各注射1针次(共200 µL/只)),免疫4次,每次间隔2周. 第1次免疫使用弗氏完全佐剂乳化蛋白液,第2次免疫用弗氏不完全佐剂乳化蛋白液. 最后2次免疫都只注射蛋白液不加任何佐剂.

    • 用稀释至5µg/mL的ESAT6中和表位肽段、诺如病毒P结构域蛋白、诺如病毒P结构域和ESAT6嵌合蛋白包被96孔板,每孔加100 µL蛋白液,4 ℃过夜进行包被. 次日取出,洗涤后每孔加入200 µL的5%脱脂牛奶,37 ℃封闭1 min;洗涤后,每孔加入100 µL的稀释的血清样品,37 ℃孵育1 h;洗涤后,每孔加入100 µL 1∶5000抗鼠IgG,37 ℃孵育1 h;洗涤后,每孔加入100 µL TMB显色液,37 ℃显色30 min后加终止液(2 mol/L H2SO4)100 µL/孔,检测OD450.

    • 重组质粒通过无缝克隆的方法构建. 将ESAT6基因片段克隆至SpeⅠ和ClaⅠ双酶切后的P结构域载体,经DNA电泳进行鉴定. 结果显示,预期大小的DNA片段成功克隆到P结构域中(图2). 进一步的测序验证了重组质粒的基因序列正确,且融合基因的阅读框完整.

      图  2  重组质粒的构建和鉴定

      Figure 2.  Construction and identification of recombinant plasmid

    • 通过在线蛋白质结构预测工具SWISS-MODEL对诺如病毒P结构域蛋白及其与ESAT6的嵌合蛋白的空间结构进行预测. 结果表明,ESAT6能很好地展现在诺如病毒P结构域二聚体的表面,尤其是ESAT6的51~70氨基酸肽段(图3).

      图  3  P结构域-ESAT6嵌合蛋白空间结构

      Figure 3.  Structure of P domain-ESAT6 chimeric protein

    • SDS-PAGE分析结果(图4)表明,ESAT6与诺如病毒P结构域嵌合蛋白能在大肠杆菌中稳定高效表达,部分以可溶性蛋白的形式存在. 通过GST亲和纯化,能从每升培养物的超声上清中得到1 mg的GST融合蛋白.

      图  4  表达和纯化后的嵌合蛋白分析

      Figure 4.  Analysis of expressed and purified chimeric protein

    • 使用Hiload 16/600 superdex 200pg柱(GE)和FPLC纯化和分析酶切后的嵌合蛋白,评价颗粒的形成效率. FPLC结果表明,P结构域蛋白和其与ESAT6嵌合蛋白的颗粒自组效率都大于95%,SDS-PAGE和Western blot结果进一步验证了FPLC分析图中2个主峰的蛋白质为预期大小的相对分子质量(图5A5B).

      图  5  酶切后嵌合蛋白的FPLC纯化和分析

      Figure 5.  Analysis of purified chimeric protein by FPLC after enzyme digestion

    • 于免疫后不同的时间点,收集小鼠血清,通过ELISA方法检测针对免疫原的特异性抗体. 结果表明,P结构域蛋白和P结构域-ESAT6嵌合蛋白都能诱导产生针对P结构域蛋白的特异性抗体,免疫后第8周的抗体效价均为1∶1 280k(图6A图6B). 然而,用嵌合蛋白包被ELISA板检测发现,P结构域蛋白免疫血清和其与ESAT6嵌合蛋白免疫血清的第8周抗体效价分别为1∶1 280k和1∶2 560k(图6C图6D),说明嵌合蛋白诱导产生了针对2种蛋白的抗体. 进一步用ESAT61-20和ESAT651-70中和表位肽段包被进行ELISA分析,结果表明嵌合蛋白中ESAT6诱导产生的抗体主要是针对ESAT651-70肽段,免疫后第八周抗体效价为1∶400(图6F),几乎不产生针对ESAT61-20肽段的抗体(图6E).

      图  6  免疫小鼠特异性抗体检测

      Figure 6.  Detection of specific antibody in immunized mice

    • 结核病是由单一传染病病原体感染引起死亡率最高的疾病[10],目前的主要预防手段仍是接种保护力有限的卡介苗[6]. 因此,研发高效、安全的新型结核疫苗的工作刻不容缓. 抗原提呈细胞的激活在疫苗诱导的免疫反应中起重要作用[21-23]. 重组表达的诺如病毒P结构域能自发地形成稳定的纳米颗粒,具有很好的免疫原性[17-19]. 因此,本研究试图探索诺如病毒P颗粒能否展示结核早期抗原ESAT6. 结果表明,ESAT6和诺如病毒P结构域形成的嵌合蛋白能高效地自组成颗粒,且具有较好的免疫原性,能诱导产生针对这两种抗原的特异性抗体.

      进一步分析发现,嵌合ESAT6片段没有降低其对诺如病毒P结构域应有的免疫原性,保持了两种抗原的相对独立性,提示利用诺如病毒P结构域呈递结核抗原ESAT6制备二价疫苗的可行性. 然而,诺如病毒P结构域形成的纳米颗粒在此是否能发挥其佐剂的效应,还有待进一步的研究.

      结核早期抗原ESAT6中有2个重要的中和抗原表位ESAT61-20和ESAT651-70[20]. 本研究将ESAT6基因克隆到诺如病毒P结构域后,蛋白质结构预测结果表明,形成的嵌合P结构域纳米颗粒中ESAT651~70肽段可能被展示在颗粒表面,而ESAT61~20肽段则可能被包埋在颗粒里面(图6E). 实验结果证实了这一预测,嵌合纳米颗粒诱导的抗体主要是针对ESAT651~70中和表位(图6F).

      本研究验证了诺如病毒P结构域能与结核早期抗原ESAT6形成嵌合纳米颗粒,且能诱导中和抗体的产生,这些研究成果为后期进一步研发结核安全、高效的新型纳米颗粒疫苗奠定了基础.

参考文献 (23)

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