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水环境污染一直以来都备受关注. 近年来，由于印染行业的迅速发展，染料污染物成为导致水环境污染的一个重要因素[1]. 染料的种类繁多，生产量大，并且在环境中不能进行自然降解，其中，结晶紫为三苯甲烷类碱性染料[2]，属于有机染料，而且由于其色度高，在水中可导致透光度降低，抑制水生植物的光合作用，并且不易生物降解. 因此为解决染料污染的问题. 需要寻求适宜的环境治理技术[3]. 在工业上通常使用吸附[4]，絮凝[5]、化学氧化[6]半导体光催化[7]等物理化学技术降解染料. 其中半导体光催化降解技术是近年来兴起的绿色、环保的环境治理技术. 相比于传统意义上的化学、物理以及生物治理技术，其利用廉价易得的太阳能，具有稳定、简便、无毒、效率高等特点. 成为人们关注的重点. 目前多数使用ZnO和TiO[8]作为光催化的反应材料，但这些半导体材料的吸收波长通常在紫外光的波长范围内，对太阳光利用率较低[9]. 为了解决这些问题，出现了耦合光催化和生物降解(ICPB)技术，并在废水污染物降解领域得到了广泛的运用. 在该技术中，研究者利用光电子在光催化剂和微生物之间转移，提供了一种协同降解方案，促进污染物的降解[10].
石墨烯(GO)是SP2结构的二维新型碳质材料，具有高比表面积（～2600 m2/g）、优良的电子传递速率（20000 cm/(V·s)）[11-12]，各层的石墨烯片的大小结构都有所不同，这个特点在一定程度上影响了石墨烯的特性，石墨烯成为一种介于导体和半导体之间的一种零带隙物质，由于其存在一定的半导体性质，使其在光催化领域有很好的应用前景[13]. 相似的，还原氧化石墨烯（rGO）具有与石墨烯相同的性质，并且其由于表面积大，可作为微生物的有效载体.
希瓦式菌是一种电子传输能力很强的革兰氏阴性γ−蛋白杆菌，可以还原多种金属和氧化物，包括氧化石墨烯[14]. 本文利用S. oneidensis MR−1的优良特性进行生物合成还原氧化石墨烯，相比于传统的化学方法Hummers 法[15]更加简便、有效、绿色. 同时，S. oneidensis MR−1也可以进行生物降解污染物.
本文对ICPB工艺进行了修改，提供了一种较为简单的方案. 采用生物合成的方法来制作S. oneidensis MR−1/还原氧化石墨烯复合材料. 然后，以三苯甲烷类碱性染料结晶紫为污染物，在厌氧条件下，复合催化剂可以利用耦合光催化和生物降解作用对目标污染物进行降解. 在这个过程中，微生物负载在还原氧化石墨烯上，在可见光的照射下，生物降解和光催化降解同时发生，显著提高了复合材料对污染物的降解能力.
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LB培养基：5 g/L yeast extract，10 g/L tryptone，5 g/L NaCl，在121 ℃条件下灭菌20 min.
矿物盐培养基：0.225 g/L K2HPO4，0.225 g/L KH2PO4，0.46 g/L NaCl，0.255 g/L (NH4)2SO4，0.024 g/L MgSO4·7H2O，4.766 g/L HEPES，微量元素5 mL∙L−1，培养基pH为7，在121 ℃条件下灭菌20 min.
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高速冷冻离心机，美国SCILOGEX公司；恒温气浴振荡培养箱，常州国华仪器公司；X射线光电子能谱仪，美国 ESCALAB 250Xi；X射线衍射仪，日本SmartLab 9 kW；透射电子显微镜，日本电子JEM−2010；液相色谱-质谱联用仪，美国LTQ Orbitrap XL；紫外−可见光谱仪，美谱达UV−1100.
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戳菌入LB培养基中在30 ℃，150 r/min条件下培养16～18 h，之后用矿物盐培养基进行两次洗菌操作（6000 r/min 5 min），重悬后利用分光光度计测量菌的OD600，通过计算使加入装有30 mL矿物盐培养基的血清瓶中的菌的OD600=0.3，然后加入300 μL（1 mg/L）的氧化石墨烯（煤化学研究所，太原，山西，中国科学院），以甲酸钠（20 mmol∙L−1）作为唯一电子供体，在30 ℃摇床中厌氧情况下反应24 h以确保石墨烯完全还原.
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本实验选用常见染料结晶紫作为目标反应物进行光催化反应. 结晶紫的结构式如图1所示.
图 1 结晶紫结构式
Figure 1. The structural formula of crystal viole
利用500 W的钨灯在控制反应温度的情况下进行光照，在光照过程中保证平行样所受到光照强度相同. 在光照一定时间后，定点取样，用注射器抽取1 mL反应液，离心（10000 r/min 10 min）取上清液，利用UV−vis分光光度计在吸光度508 nm处测定上清液中染料的浓度. 直至结晶紫降解完全.
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取还原24 h后的石墨烯样品4 mL离心（1000 r/min 10 min）弃上清液，用乙醇固定，再利用JEM−2100电子显微镜在200 kV的加速电压下利用透射电子显微镜(TEM)观察形貌，用X射线光电子能谱（XPS）分析确定合成的S. oneidensis MR−1/石墨烯的表面的官能团变化和分子结构. X射线衍射仪（XRD）测定样品的晶体合成情况，利用生产的UV−vis分光光度计在结晶紫染料的最大吸光度508 nm处测量反应过程中染料吸光度变化.
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本文利用S. oneidensis MR−1对氧化石墨烯进行了还原和修饰. 如图2所示，氧化石墨烯附着在微生物表面，通过微生物呼吸介导作用将其还原，然后包裹在微生物表面形成S. oneidensis MR−1/石墨烯复合材料[16]. 通过TEM表征观察复合材料的形貌结构. 如图3所示，微生物菌体呈杆状，其表面被质地较薄且透明的膜状物质包裹. 该物质可能是氧化石墨烯及其衍生物. 这与图2的分析结果一致.
图 2 S. oneidensis MR−1/还原氧化石墨烯复合材料合成机理图
Figure 2. Synthesis mechanism diagram of S. oneidensis MR−1 / rGO complex
图 3 S. oneidensis MR−1/石墨烯的透射电子显微镜图
Figure 3. Transmission electron microscopy of S. oneidensis MR−1 /rGO
为了进一步了解薄膜物质，利用XRD定性分析复合材料的晶型结构. 如图4所示对比复合材料和氧化石墨烯的XRD图谱可以发现，氧化石墨烯样品在10.4°出现一个强烈的峰，但在复合材料中尖峰消失，同时在27.2°出现了新的衍射峰. 这是氧化石墨烯在被逐渐还原的过程中，含氧官能团被去除的缘故[17]. 结合TEM的结果，可以证实薄膜物质为还原氧化石墨烯.
图 4 XRD分析图
Figure 4. XRD analysis diagram
最后利用XPS分析样品表面的官能团,再一次确定氧化石墨烯的还原情况，图5（a）（b）分别为氧化石墨烯和复合材料C1s光谱. 284.8，286.7 eV和288.4 eV分别对应C＝C双键、C―O单键和C＝O双键. 如图5（b）所示，复合材料中虽然仍旧含有含氧官能团，但286.7 eV和288.4 eV处的峰值相对强度显著下降，284.8 eV处的峰值相对强度显著增强. 这些变化表明复合材料中的含氧官能团的去除和SP2结构域的形成，这与文献[18]中有关GO还原成rGO的分析一致. 结合TEM和XRD的结果，确定了S. oneidensis MR−1/还原氧化石墨烯复合材料已经形成.
图 5 GO与复合材料的XPS分析图
Figure 5. XPS analysis chart of GO and composites
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如图6所示，单独利用S. oneidensis MR−1进行反应时，并不能使结晶紫脱色. 这意味着复合材料对结晶紫的降解不是由于生物降解或是生物吸附的结果. 而且当采用高温灭菌的方式将复合体中的菌体灭活时，也并未使结晶紫脱色. 体现了在这个光催化体系中活菌的重要性. 相比之下，S. oneidensis MR−1/石墨烯复合材料在黑暗条件下对结晶紫存在着较好的降解效率，在10 h左右实现了63.7%的降解率，这是由于还原氧化石墨烯提高了电子传输速率，从而促进了S. oneidensis MR−1对结晶紫的生物降解[19]. 同时，在光照条件下，10 h的降解率达到81.7%，相比于暗反应，结晶紫的降解速率明显增加，就是说光照对这个体系的反应有明显的增强作用. 在这个反应过程中，生物降解和光催化降解同时进行.
图 6 不同条件下结晶紫降解情况
Figure 6. The degradation of crystal violet under different conditions
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为了进一步探求光照增强S. oneidensis MR−1/石墨烯体系的机理，我们对其进行了自由基捕获实验. 在光照条件下，光催化剂通常产生各种活性物质，例如h+（空穴）和OH·（羟基自由基）等，这些物质通常参与到光催化降解的过程中[20]. EDTA（乙二胺四乙酸）和IPA（异丙醇）在先前的研究中可以作为空穴和羟基自由基的清除剂. 也就是说EDTA和IPA可有效捕获h+和OH·[21]. 实验结果如图所见，当加入这两种不同自由基捕获剂时，光催化降解结晶紫的效率都存在一定程度上的抑制. 于图7中所示，当添加一定浓度的EDTA和IPA时S. oneidensis MR−1/石墨烯体系反应10 h的降解效率分别为77.8%和77.1%，略高于未添加捕获剂的暗反应的71.1%，而存在可见光参与时，降解效率可以达到86.9% ，说明在这个光催化降解体系中，在光催化过程中是多种自由基共同参与的，OH·和h+起着重要作用，但并不是唯一决定因素.
图 7 自由基捕获剂对结晶紫降解的影响
Figure 7. The effect of free radical catcher on degradation of crystal violet
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通过表征以及对自由基捕获实验的结果对光照增强S. oneidensis MR−1/还原氧化石墨烯反应体系的机理进行初步的推测. 在脱色反应过程中，存在生物降解和光催化降解两种进程. 在生物降解过程中，还原氧化石墨烯可以作为载体，通过增强S. oneidensis MR−1的电子传输效率，由此提高S. oneidensis MR−1对污染物的生物降解能力[22]. 而光催化反应一般在两种条件下发挥作用. 一是通过半导体或具有半导体性质的材料吸收光子导致其电子跃迁产生空穴和电子，空穴和H2O反应产生OH·，同时电子和氧气反应也产生OH·，从而促使目标反应物的降解，在这个过程中，起主要作用的为羟基自由基，而羟基自由基的产生主要是通过与氧气的反应，所以在大多数情况下，光催化反应在好氧条件下进行[23-24]. 然而，在好氧光催化反应中，光电子容易和空穴产生复合，导致光催化降解效率大大降低. 本文讨论了在厌氧条件下进行光催化降解时，复合材料的光催化性能. 该反应利用石墨烯带隙能窄这一特性，在可见光照射下，电子从低能的导带跃迁至高能的价带，从而产生空穴和电子. 在光催化降解的过程中可能存在两种机理，一是由于S. oneidensis MR−1优良的电子传输能力，从而导致电子源源不断地补充空穴，抑制了空穴的复合[25-26]. 促使光电子的不断产生，提高了染料降解的效率. 二是光电子被转移到微生物，给微生物提供电子，使微生物存在更多的电子转移. 从而促使目标污染物降解. 根据自由基捕获实验的结果分析，S. oneidensis MR−1/还原氧化石墨烯反应体系的光催化反应机理更倾向于后者. 如图8所示，在本文的光催化进程中，在可见光照射下，激发的光电子一部分直接作用于污染物，一部分传递给微生物，通过电子传递作用于污染物. 同时，空穴可以与水反应形成OH·，促进污染物的降解.
图 8 光催化降解结晶紫机理图
Figure 8. The mechanism diagram of photocatalytic degradation of crystal violet
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本文利用希瓦式菌生物原位还原氧化石墨烯的方法制作S. oneidensis MR−1/还原氧化石墨烯复合体，在可见光的照射下对结晶紫染料进行光催化降解反应，在10 h光催化反应后结晶紫的去除效率可达到81.7%. 提出了一种绿色高效的染料降解方法. 而且通过自由基捕获实验发现，在这个光催化体系中，OH·和h+起到了重要的作用，但不是唯一决定性作用. 最后探求了光催化机理，在整个光催化降解体系中，可见光激发空穴和电子的产生和还原氧化石墨烯和菌之间光电子传递起到了重要的作用，对理解生物光电还原降解机制提供了新的思路.
Shewanella oneidensis MR−1/还原氧化石墨烯复合材料的制备及其光催化性能
On preparation and photocatalytic properties of Shewanella oneidensis mr−1/rGO composites
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摘要: 利用异化金属还原菌Shewanella oneidensis MR−1还原氧化石墨烯，合成S.oneidensis MR−1/还原氧化石墨烯复合材料，通过透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）、X射线光电子能谱分析（XPS）对复合材料进行表征分析，同时研究该复合材料光催化降解结晶紫的催化效果. 结果表明，棒状微生物的表面包裹着还原氧化石墨烯薄膜，从而形成复合材料. 在厌氧条件下，可见光可以促进该复合材料对结晶紫的脱色效率；同时，在结晶紫降解过程中，提出了耦合还原氧化石墨烯的光催化作用和S.oneidensis MR−1生物降解作用的机理，为生物光催化降解体系的降解机理提供了新的见解.
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关键词:
- Shewanella oneidensis MR−1 /
- 石墨烯 /
- 光催化 /
- 耦合光催化 /
- 生物降解
Abstract: Shewanella oneidensis MR−1 was synthesized from reduced GO by Shewanella oneidensis MR−1. Reduced GO composites were characterized by transmission electron microscopy (TEM), X−ray diffraction (XRD) and X−ray photoelectron spectroscopy (XPS), and the catalytic effect of photocatalytic degradation of crystal violet was studied. The results showed that the rod−like microorganisms were coated with rGO films to form composites. Under the Rcondition of anaerobic, visible light can promote the decolorization efficiency of crystal violet. Meanwhile during the process of degradation of crystal violet, the photocatalysis and the biodegradation mechanism of Shewanella oneidensis MR−1 of coupled reduced GO were proposed, which provided new insights for the degradation mechanism of biophotocatalytic degradation system. -
图 2 S. oneidensis MR−1/还原氧化石墨烯复合材料合成机理图
Figure 2. Synthesis mechanism diagram of S. oneidensis MR−1 / rGO complex
图 3 S. oneidensis MR−1/石墨烯的透射电子显微镜图
Figure 3. Transmission electron microscopy of S. oneidensis MR−1 /rGO
图 6 不同条件下结晶紫降解情况
Figure 6. The degradation of crystal violet under different conditions
图 7 自由基捕获剂对结晶紫降解的影响
Figure 7. The effect of free radical catcher on degradation of crystal violet
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