双孢线虫草真菌群落结构及多样性分析

汤德相 王笑研 王元兵 孙涛 胡卫红 虞泓

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双孢线虫草真菌群落结构及多样性分析

    作者简介: 德 相(1994−),女,贵州人,硕士生,主要研究宏基因组学. E-mail:1347974204@qq.com;王笑研(1993−),女,河南人,硕士生,主要从事宏基因组学研究. E-mail:1423825103@qq.com;
    通讯作者: 胡卫红, hwh661006@tom.com ; 虞泓, hongyu@ynu.edu.cn
  • 中图分类号: Q93

Diversity and structure analysis of fungal community on Ophiocordyceps bispora

    Corresponding author: HU Wei-hong, hwh661006@tom.com ;YU Hong, hongyu@ynu.edu.cn
  • CLC number: Q93

  • 摘要: 双孢线虫草周围的微生物对其生长以及适应环境有着重要作用,其微生境的微生物群落结构和多样性与环境的相互作用有待研究. 探究不同的海拔梯度和光照强度对双孢线虫草真菌群落结构和多样性的影响. 通过Illumina MiSeq高通量测序技术对5组双孢线虫草样本的ITS2区域进行测序,比较不同海拔梯度和光照强度的5组样本真菌多样性、丰富度和群落结构. 从5组样本中共检测到445个真菌OTUs. 真菌群落结构分析表明共有3门、13个纲、41个目、69个科、66个属和257个物种,子囊菌门为优势门,优势属以线虫草属为主,还存在其他真菌属定植. α指数分析表明真菌群落的丰富度和多样性与海拔梯度不存在显著相关性,光照强度、植被类型和人为活动可能是影响真菌群落的丰富度和多样性的环境因素. 真菌核心OTUs和Anosim分析表明,双孢线虫草的真菌群落结构有14属与海拔梯度成正相关性,双孢线虫草真菌群落组间存在显著差异. 双孢线虫草蕴藏着丰富的真菌资源. 海拔梯度与双孢线虫草真菌多样性以及丰富度没有显著相关性,双孢线虫草真菌群落结构有14个属与海拔梯度成正相关. 本研究还发现光照强度、人为活动以及植被类型也可能是引起双孢线虫草真菌群落结构、真菌多样性以及丰富度的重要环境因素. 该结果有利于为双孢线虫草真菌群落和环境相互作用提供研究思路.
  • 图 1  双孢线虫草

    Figure 1.  Ophiocordyceps bispora

    图 2  稀释曲线

    Figure 2.  Rarefaction curve

    图 3  各样本α多样性指数

    Figure 3.  Alpha diversity index of each sample

    图 4  门水平上的真菌群落组成

    Figure 4.  Fungal community composition at phylum level

    图 5  属水平上的真菌群落组成

    Figure 5.  Fungal community composition at genus level

    图 6  移除线虫草属后不同样点的真菌群落组成

    Figure 6.  Fungal community composition of different samples after removed Ophiocordyceps

    图 7  不同样点的核心OTUs

    Figure 7.  Core OTUs of different sample

    图 8  不同样点Anosim分析

    Figure 8.  Anosim analysised in different of samples

    图 9  双孢线虫草真菌群落组间T-test检验(a,b,c);真菌群落和海拔梯度相关性分析(d)

    Figure 9.  Between groups of Ophiocordyceps bispora fungal community be T-tested(a,b,c);correlation analysised of fungal community and Elevation gradients(d)

    表 1  样本采集具体信息

    Table 1.  Information of sample collected

    样本名称海拔梯度/m光照类型采样点特征
    OFA2000背阴面人类活动频繁的光秃道路和道路两旁
    OFB2045背阴面草本植物根系及根系旁边
    OFC2139背阴面密集树木下的土壤表面
    OFD2167山顶光秃的山顶,石头边缘或石头底部
    OFE2082太阳面针阔混交林下的土壤中,土壤较硬并且经常有人类活动
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    表 2  α多样性指数与海拔梯度相关性分析

    Table 2.  Correlation was analyzed between alpha diversity index and elevation gradients

    α多样性指数皮尔逊检验
    香农-威纳指数F=0.464P=0.431
    辛普森指数F=0.420P=0.482
    Chao指数F=0.076P=0.903
    ACE指数F=0.128P=0.083
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-07-15
  • 录用日期:  2021-05-30
  • 网络出版日期:  2021-08-11

双孢线虫草真菌群落结构及多样性分析

    作者简介:德 相(1994−),女,贵州人,硕士生,主要研究宏基因组学. E-mail:1347974204@qq.com
    作者简介:王笑研(1993−),女,河南人,硕士生,主要从事宏基因组学研究. E-mail:1423825103@qq.com
    通讯作者: 胡卫红, hwh661006@tom.com
    通讯作者: 虞泓, hongyu@ynu.edu.cn
  • 1. 云南大学 生态学与环境学院 云百草实验室,云南 昆明 650091
  • 2. 云南大学 中国(云南)—东南亚虫草生物资源可持续利用国际联合研究中心,云南 昆明 650091
  • 3. 云南大学 生命科学学院,云南 昆明 650091

摘要: 双孢线虫草周围的微生物对其生长以及适应环境有着重要作用,其微生境的微生物群落结构和多样性与环境的相互作用有待研究. 探究不同的海拔梯度和光照强度对双孢线虫草真菌群落结构和多样性的影响. 通过Illumina MiSeq高通量测序技术对5组双孢线虫草样本的ITS2区域进行测序,比较不同海拔梯度和光照强度的5组样本真菌多样性、丰富度和群落结构. 从5组样本中共检测到445个真菌OTUs. 真菌群落结构分析表明共有3门、13个纲、41个目、69个科、66个属和257个物种,子囊菌门为优势门,优势属以线虫草属为主,还存在其他真菌属定植. α指数分析表明真菌群落的丰富度和多样性与海拔梯度不存在显著相关性,光照强度、植被类型和人为活动可能是影响真菌群落的丰富度和多样性的环境因素. 真菌核心OTUs和Anosim分析表明,双孢线虫草的真菌群落结构有14属与海拔梯度成正相关性,双孢线虫草真菌群落组间存在显著差异. 双孢线虫草蕴藏着丰富的真菌资源. 海拔梯度与双孢线虫草真菌多样性以及丰富度没有显著相关性,双孢线虫草真菌群落结构有14个属与海拔梯度成正相关. 本研究还发现光照强度、人为活动以及植被类型也可能是引起双孢线虫草真菌群落结构、真菌多样性以及丰富度的重要环境因素. 该结果有利于为双孢线虫草真菌群落和环境相互作用提供研究思路.

English Abstract

  • 双孢线虫草Ophiocordyceps bispora是亚洲新纪录种[1]. Stifler[2]首次发现双孢线虫草在非洲坦桑尼亚,寄主为纳塔尔大白蚁Macrotermes natalensis,Sung等[3]用多基因片段对双孢线虫草进行分子系统发育分析,确定双孢线虫草隶属于线虫草科Ophiocordycipitaceae,线虫草属Ophiocordyceps. 目前,双孢线虫草的研究主要见于生物防治、活性成分以及微生物多样性等方面. 双孢线虫草活性成分研究表明其含有丰富的核苷类、多糖及甘露醇等活性成分,双孢线虫草的菌丝体对果蝇具有延缓衰老的特性[1].

    野外调查双孢线虫草发现该物种可以侵染白蚁Macrotermes sp.,致使巢穴中群居的白蚁Macrotermes sp.大量死亡,在实验室内对双孢线虫草无性型研究也发现,让白蚁自由爬行在接有双孢线虫草分生孢子的无菌土壤上,可导致白蚁相对高水平的感染,本课题组在野外调查也发现同样现象[1, 4-6]. 通过高通量测序发现双孢线虫草具有丰富的真菌资源,不同生境下双孢线虫草的真菌多样性和群落结构具有差异[4],该现象在其他虫草中也有报道,如冬虫夏草Ophiocordyceps sinensis、新古尼异虫草Metacordyceps neogunnii和蝉花虫草Isaria cicadae[7-9]. 本课题组野外调查发现,双孢线虫草分布在针阔混交林下,沿海拔梯度呈现不同密集程度的聚集死亡. 研究报道山地生态系统海拔梯度差异较大,在较短的地理距离内可出现气候和生物特征的显著变化,环境梯度变化会影响微生物的群落结构、组成以及多样性[10]. 光照的不同程度如:背阴面和向阳面会导致温度具有差异,从而影响微生物的分布格局[11]. 研究已证明海拔梯度和光照强度是影响微生物群落的关键因子[12]. 因此,海拔梯度可能是影响双孢线虫草微生物群落结构组成和多样性的重要因素. 前人只对不同生境双孢线虫草微生物多样性进行了比较[4],但不同的海拔梯度以及其他环境因子,如光照强度对双孢线虫草真菌群落结构及多样性的影响没有进行深入研究. 本研究初步探讨海拔梯度和光照强度对双孢线虫草真菌群落结构和多样性分布格局的影响,有利于为双孢线虫草真菌群落与环境相互作用提供数据参考.

    • 双孢线虫草样本于2018年7月采自云南省玉溪市新平县新化乡(北纬24.12,东经101.85). 虫草样本处于成熟阶段,根据海拔梯度及结合野外虫草分布的特点在山的背阴面设置3个采样点(OFA,OFB,OFC),第4个采样点OFD为光秃的山顶,第5个采样点OFE在山的向阳面. 固定样方10 m×10 m内随机采集样本,每个样点采集5份重复样(图1表1). 样本用75%酒精进行表面消毒2~3 min,30% 过氧化氢溶液浸泡3~5 min,再用无菌水冲洗3次[13]. 将处理后的所有样本装入无菌离心管并放入液氮运回,保存于−80°备用.

      图  1  双孢线虫草

      Figure 1.  Ophiocordyceps bispora

      样本名称海拔梯度/m光照类型采样点特征
      OFA2000背阴面人类活动频繁的光秃道路和道路两旁
      OFB2045背阴面草本植物根系及根系旁边
      OFC2139背阴面密集树木下的土壤表面
      OFD2167山顶光秃的山顶,石头边缘或石头底部
      OFE2082太阳面针阔混交林下的土壤中,土壤较硬并且经常有人类活动

      表 1  样本采集具体信息

      Table 1.  Information of sample collected

    • 用试剂盒Micro Elute Genomic DNA Kit D3096提取不同样点的双孢线虫草总DNA,其操作步骤按照试剂盒说明书进行. 根据说明书进行样本总DNA的提取,对DNA的纯度和浓度用琼脂糖凝胶电泳检测. PCR扩增用ITS2引物ITS4-2409R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS3-2024F(5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)对目标区域进行扩增,反应过程如下:95° 5 min,95° 30 s,60° 30 s,72° 20 s,30个循环;最后72°延长5 min. 反应产物于Thermofisher的Ion S5TMXL进行上机测序.

    • 经Illumina MiSeq高通量测序得到的序列根据Barcode和PCR扩增引物拆分出各样本数据,截去Barcode和PCR扩增引物得到reads,根据PE reads之间的overlap关系,将成对的reads拼接成原始Tags数据(Raw Tags),对原始数据进行截取、过滤和去除嵌合体序列后得到有效序列. 用于OTU聚类和基于代表序列作分类学分析.

    • 将所有样品用Uparse 软件(Uparse v 7.0.1001,http://drive5.com/uparse/)按相似度≥ 97%聚类为OTU(operational taxonomic unit),选取每个最长的OTU作为代表性序列,用blast(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)与Unit(https://unite.ut.ee/)数据库进行物种分类注释. 样本序列按54 780 bp用于后续分析. α多样性分析用Uparse 软件(Uparse v 7.0.1001)计算Chao1、Ace、Shannon和Simpson多样性指数,当Shannon、Simpson、ACE和Chao1指数越高时表示样本多样性及丰富度越高,反之则低. 用Excel绘制门、属和种水平上的群落结构,Pearson做相关性分析,用MetaCoMET(http://probes.pw.usda.gov/MetaCoMET)在线网络平台分析核心OTU,用ANOSIM比较真菌群落是否差异.

    • 本研究所用的25份样品因3份(OFA5、OFB3和OFC2)达不到建库要求被剔除后重新编号,因此只对22份样本进行测序分析. 22份样本共获得有效序列46 448~65 759条,基于OTU Number水平绘制稀释曲线,各样本OTU为13~76个,随着样本序列数的增加,可检测到的OTU趋近于平缓状态,说明此次实验数据合理并能够能反映物种多样性(图2). 从22份样本中共检测到445个真菌OTUs,隶属于3门、13个纲、41个目、69个科、66个属和257个物种.

      图  2  稀释曲线

      Figure 2.  Rarefaction curve

    • 双孢线虫草各样点不同海拔梯度α多样性见图3. 结果表明,样点OFC多样性最高,OFB次之,OFE多样性最低. 从图中结果分析来看,随着海拔的升高,双孢线虫草真菌多样性也呈现逐渐升高的现象. 背阴面-山顶的4个样点OFA、OFB、OFC和OFD的真菌多样性与海拔梯度呈现上升的趋势. 经Pearson对真菌多样性与海拔梯度相关性分析发现,真菌多样性与海拔高度不存在显著相关性(p>0.05,表2),可能海拔梯度变化较小不足以导致多样性显著不同. 山顶样点OFD相比于OFC和OFB样点真菌多样性较低,出现这种结果可能是OFC和OFB样点的植被类型与其他样点不同导致,OFC和OFB样点相比其他3个样点有茂密的草丛和树林遮挡,可以较好的减少光的直接照射,OFD样点海拔和光照都都比OFE样点更高和更强,但OFE样点多样性却比OFD更低,OFE样点相比于其他样点有人类活动频繁的特征. 因此,双孢线虫草真菌群落多样性可能不仅受光照的影响,植被类型以及人为活动也可能是影响双孢线虫草真菌群落多样性因素.

      图  3  各样本α多样性指数

      Figure 3.  Alpha diversity index of each sample

      α多样性指数皮尔逊检验
      香农-威纳指数F=0.464P=0.431
      辛普森指数F=0.420P=0.482
      Chao指数F=0.076P=0.903
      ACE指数F=0.128P=0.083

      表 2  α多样性指数与海拔梯度相关性分析

      Table 2.  Correlation was analyzed between alpha diversity index and elevation gradients

      双孢线虫草真菌丰富度最高的样点是OFE,样点OFA、OFB、OFC和OFD丰富度差异较小. 随着海拔梯度的升高双孢线虫草真菌丰富度也呈现逐渐升高的趋势,从表2可见,真菌丰富度与海拔高度也不存在显著相关性(p>0.05). OFB样点的丰富度比OFC样点高,出现这种现象可能由于OFB样点的植被与OFC样点不同导致,OFB样点的植被为草丛,相比OFC样点植被为树林可能所受光照强度不同. OFE样点为山的向阳面,其光照强度和海拔梯度均不如山顶样点OFD,但OFE样点的丰富度却最高,出现这种结果可能还与其他因素有关,OFE样点是人类活动比较频繁的样地,并且有针阔混交林遮挡光照. 双孢线虫草真菌群落丰富度可能受光照强度的影响,而人类活动以及植被可能也是影响双孢线虫草真菌群落丰富度的因素.

    • 测序结果表明,双孢线虫草不同采样点共检测到445个真菌OTUs,隶属于3门、66个属和257个物种. 样本中共检测的3个门分别为子囊菌门Ascomycota、担子菌门Basidiomycota和接合菌门Zygomycota(图4),其中子囊菌门为各个样本的优势门,相对丰度为98.84%~99.95%. 担子菌门和接合菌门相对丰度较低0.01%~1.1%.

      图  4  门水平上的真菌群落组成

      Figure 4.  Fungal community composition at phylum level

      对双孢线虫草进行属水平上的分析(图56),相对丰度<0.001%的归类为其他. 结果显示,各采样点的样本都是以线虫草属Ophiocordyceps占主导优势84.85%~97.64%. 图6是移除线虫草属仅对相对丰度>0.01%的属进行分析,结果显示,优势属枝穗霉属Clonostachys相对丰度为0.62%~14.61 %,多头霉属Polycephalomyces相对丰度为0.14%~8.48%,木霉属Trichoderma 0.03%~0.22%,Purpureocillium 0.01%~0.16%,镰刀菌属Fusarium 0.01%~0.04%和被孢霉属Mortierella 0.01%~0.27%. 随着海拔梯度及光照强度的变化,枝穗霉属和多头霉属的相对丰度呈现先上升后下降的趋势,多头霉属相对丰度在OFB样点达到最大值,枝穗霉属相对丰度在OFC样点达到最大值,OFB和OFC样点植被与其他样点不同,两个优势属分别在OFB和OFC样点相对丰度达到最大值可能与植被类型有着密切的关系.

      图  5  属水平上的真菌群落组成

      Figure 5.  Fungal community composition at genus level

      图  6  移除线虫草属后不同样点的真菌群落组成

      Figure 6.  Fungal community composition of different samples after removed Ophiocordyceps

    • 双孢线虫草各样本通过MetaCoMET网络在线平台分析,结果显示,5组样本共检测到445个OTUs,OFA样点有73个OTUs,OFB样点有79个,OFC样点有71个,OFD样点有92个,OFE样点有130个,5个不同采样点共有核心OTUs有41个(图7). 随着海拔梯度的升高,背阴面的3个样点OTU数量相近,OFD样点相比背阴面的3个样点OTU数量呈现上升的趋势,OFD样点在山顶,光照比背阴面较为强烈,可能是导致山顶样点OTU数量较背阴面样点多的原因. 样点OFE的OTUs数量比样点OFD高,OFE样点为山的向阳面,其光照强度和海拔梯度均不如山顶样点OFD,出现这种结果可能还与植被或人为活动有关,OFE样点是人类活动比较频繁的样点,并且具有稀疏的植被遮挡,可能人为活动、植被以及光照强度是共同导致各样点核心OTUs数量不同的原因,这也与上文丰富度分析结果一致.

      图  7  不同样点的核心OTUs

      Figure 7.  Core OTUs of different sample

    • 运用Anosim分析双孢线虫草的真菌群落在组间的差异是否显著大于组内差异,从而判断是否有意义(图8). 结果显示,R=0.093,R>0则说明各组间是具有显著差异的. 通过T-test检验,OFE和OFB样点、OFE和OFC样点、OFE和OFD样点两两比较发现,真菌群落只有Mortierella 在组间具有显著差异P<0.05(图9a9b9c). 通过Pearson对双孢线虫草真菌群落和海拔梯度的相关性分析,结果显示,双孢线虫草真菌群落有14个属与海拔梯度呈现正相关(图9d).

      图  8  不同样点Anosim分析

      Figure 8.  Anosim analysised in different of samples

      图  9  双孢线虫草真菌群落组间T-test检验(a,b,c);真菌群落和海拔梯度相关性分析(d)

      Figure 9.  Between groups of Ophiocordyceps bispora fungal community be T-tested(a,b,c);correlation analysised of fungal community and Elevation gradients(d)

    • 本文通过Illumina MiSeq测序对双孢线虫草真菌群落多样性和真菌群落结构进行了分析,测序结果表明,从22份样本中共检测到445个真菌OTUs,隶属于3门、13个纲、41个目、69个科、66个属和257个物种,显示出丰富的真菌资源. 子囊菌门是一个广泛存在于多数虫草中的优势门,与冬虫夏草、蝉花虫草以及新古尼异虫草研究结果一致[7-9]. 除线虫草属为优势属外,还存在一些其他优势属,表明双孢线虫草也存在定植现象,与蝉花虫草和新古尼异虫草研究结果相似[7-8]. 各样点其他优势属分别为枝穗霉属、多头霉属、木霉属、镰刀菌属、被孢属和Purpureocillium,真菌优势属随着海拔梯度及光照强度的变化,在各个样点里的相对丰度变化较小,但枝穗霉属和多头霉属随着海拔梯度和光照强度的变化,相对丰度呈现先上升后下降的趋势,OFB和OFC样点的植被类型可能是影响枝穗霉属和多头霉属相对丰度分别在两个样点达到最大值的原因. 值得关注的是,分析双孢线虫草优势属发现与前人研究冬虫夏草真菌多样性的优势属类群有所不同[9, 13],研究报道,优势属枝穗霉属、木霉属、镰刀菌属等在农作物病虫害防治和改善土壤环境方面具有重要作用[14-15],并且还是土壤质量重要的检测指标,本文中双孢线虫草的真菌优势属也侧面表明该地区受重金属污染较小,土壤环境质量较好[16].

      分析真菌群落多样性和丰富度发现,随着海拔梯度的升高,双孢线虫草真菌多样性和丰富度呈现逐渐递增的趋势. 经过Pearson检验得出海拔梯度与双孢线虫草真菌多样性和丰富度没有显著相关性(P>0.05),但双孢线虫草真菌群落与海拔梯度有14个真菌属具有正相关性,这与暴家兵等研究海拔梯度对细菌群落结构具有显著差异不太一致[17]. 可能是本文中各样点所设置的海拔梯度距离较小,以及本文研究对象是真菌群落导致. 各样点存在真菌多样性和丰富度的不同,双孢线虫草真菌群落多样性和丰富度除了受光照强度的影响外,可能还受植被类型以及人为活动的影响,适当的人为干扰是促成真菌多样性丰富度较高的一个重要因素,这与也前人研究双孢线虫草微生物群落结构受生境影响的结果相似[4].

      分析双孢线虫草的真菌核心OTU得出,各个采样点(背阴面-山顶)OTU数量随着海拔梯度的升高变化较小,但OFE样点的OTUs数量比其他样点高,OFE样点为山的向阳面,其光照强度和海拔梯度均不如山顶样点OFD,各样点核心OTUs除受光照影响外,可能还与植被或人为活动有关. 通过Anosim差异分析得出各组间真菌群落具有显著差异,通过T-test检验发现组间仅有真菌Mortierella具有显著差异(P<0.05). 之前研究报道,Mortierella对重金属污染较为敏感[16],本文研究得出OFE样点与OFB、OFC和OFD样点的Mortierella具有显著差异(P<0.05),背阴面的OFB和OFC样点,以及山顶的OFD样点可能重金属含量与向阳面OFE具有差异,具体是怎样导致的差异还有待进一步研究.

参考文献 (17)

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