基于球形金−银纳米笼比色法检测谷胱甘肽和谷胱甘肽转移酶

肖传豪 穆之琳 陈郑博

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基于球形金−银纳米笼比色法检测谷胱甘肽和谷胱甘肽转移酶

    通讯作者: 肖传豪, xiaoshihui1@163.com
  • 中图分类号: O65

Colorimetric detection of glutathione and glutathione transferase based on spherical gold-silver nanocage

    Corresponding author: XIAO Chuan-hao, xiaoshihui1@163.com ;
  • CLC number: O65

  • 摘要: 基于Ag-Au球形纳米笼具有类似过氧化物酶的活性,建立了一种比色检测GSH和GST的方法. Ag-Au纳米笼催化TMB和H2O2反应,652 nm处观察到清晰的紫外吸收峰,溶液从无色(TMB)变为蓝色(oxTMB). 当GSH存在时,oxTMB被GSH还原成TMB,652 nm处吸光度降低,颜色由蓝色变浅. 当GST存在时,GST特异性结合GSH,有效地抑制oxTMB被GSH还原,导致652 nm处的吸光度增大,溶液颜色由无色变为蓝色. 在最佳反应条件下,GSH和GST的检测线性范围分别为0.5~1.0 μmol/L(R2=0.986)和1~50 mg/L(R2=0.999). 该方法具有较好的选择性,将该方法用于实际血清样品中GSH和GST的检测,得到了满意的结果.
  • 图 1  利用Ag-Au纳米笼催化TMB-H2O2反应比色检测GSH和GST示意图

    Figure 1.  Schematic of colorimetric detection of GSH and GST based on TMB-H2O2 reaction catalyzed by Ag-Au nanocage

    图 2  Ag-Au纳米笼的纳米粒子表征

    Figure 2.  Characterization of nanoparticles in Ag-Au nanocages

    图 3  不同浓度氯金酸对Ag-Au纳米笼吸光度的影响

    Figure 3.  Effect of different concentrations of chloroauric acid on the absorbance of Ag-Au nanocages

    图 4  TMB/H2O2浓度比对oxTMB溶液吸光度的影响

    Figure 4.  Effect of TMB/H2O2 concentrations on the absorbance of oxTMB

    图 5  最佳反应条件下不同浓度GSH溶液紫外检测光谱曲线

    Figure 5.  The UV detection spectra of GSH solutions with different concentrations under the optimal reaction conditions

    图 6  GST紫外检测光谱曲线

    Figure 6.  The UV detection spectra of GSH solutions

    表 1  血清样品中GSH和GST回收结果(n=3)

    Table 1.  Recovery results of GSH and GST in serum samples (n=3)

    待检物未加标加标量检测结果RSD/%回收率/%
    GSH 0.42 μmol/L 0.2 μmol/L 0.59 μmol/L 3.7 95.16
    0.4 μmol/L 0.83 μmol/L 5.2 98.80
    0.5 μmol/L 0.89 μmol/L 3.3 103.37
    GST 1 mg/L 0.95 mg/L 5.6 95
    5 mg/L 5.06 mg/L 4.5 101.2
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-11-18
  • 录用日期:  2021-03-30
  • 网络出版日期:  2021-05-19
  • 刊出日期:  2021-09-15

基于球形金−银纳米笼比色法检测谷胱甘肽和谷胱甘肽转移酶

    通讯作者: 肖传豪, xiaoshihui1@163.com
  • 1. 濮阳职业技术学院,河南大学 濮阳工学院,河南 濮阳 457000
  • 2. 首都师范大学 化学系,北京 100048

摘要: 基于Ag-Au球形纳米笼具有类似过氧化物酶的活性,建立了一种比色检测GSH和GST的方法. Ag-Au纳米笼催化TMB和H2O2反应,652 nm处观察到清晰的紫外吸收峰,溶液从无色(TMB)变为蓝色(oxTMB). 当GSH存在时,oxTMB被GSH还原成TMB,652 nm处吸光度降低,颜色由蓝色变浅. 当GST存在时,GST特异性结合GSH,有效地抑制oxTMB被GSH还原,导致652 nm处的吸光度增大,溶液颜色由无色变为蓝色. 在最佳反应条件下,GSH和GST的检测线性范围分别为0.5~1.0 μmol/L(R2=0.986)和1~50 mg/L(R2=0.999). 该方法具有较好的选择性,将该方法用于实际血清样品中GSH和GST的检测,得到了满意的结果.

English Abstract

  • 谷胱甘肽(GSH)是细胞内最丰富的巯基化合物,细胞GSH浓度的变化与衰老、心脏病、癌症、白细胞减少、肝损伤、HIV和神经退化性疾病有关[1-2]. 谷胱甘肽转移酶(GST)在肝细胞液中含量较高,通过催化GSH与活性代谢产物结合,在降低毒性和促进尿排泄方面发挥重要作用[3]. GST已被证明是肺癌、卵巢癌、乳腺癌和胃癌等肿瘤的重要标志物[4].

    目前已发展了多种分析方法检测GSH,如色谱法[5-6]、光度法[7]、质谱法[8]和免疫发光法[9]等. 对于GST检测,目前已发展了一些检测方法,包括比色法、生物发光探针法、荧光微板法、金属有机抑制剂和光学方法[10-14]. 然而,这些方法由于存在成本高、灵敏度低、预处理繁琐等缺点[15],限制了它们在生化分析中的应用. 而比色法因其可简单地用肉眼读出而备受关注[16-17].

    本文以制备的具有过氧化物酶活性的球形Ag-Au纳米笼作为催化剂,催化3,3′,5,5-四甲基联苯胺(TMB)和过氧化氢(H2O2)反应,生成蓝色的TMB氧化产物(oxTMB)并在652 nm出现紫外吸收峰. 不同浓度GSH的加入造成oxTMB被还原,从而引起溶液由蓝色变浅,652 nm处的吸光强度减小. GST和GSH的特异性作用使得GSH对TMB和H2O2的反应抑制程度减弱,颜色由浅变成深蓝色,652 nm处的吸光度增强. 从而实现了一种简单、快速、灵敏、专一检测GSH和GST的比色方法,并用于人血清样品中的GSH和GST的测定,获得了满意的结果.

    • UV−2550型紫外可见(UV-vis)吸收光谱仪(苏州生产);H−7560型透射电子显微镜(日本日立公司);SU−8000型透射电子显微镜(日本日立公司).

      硝酸银(99.7%)、氯金酸(99.9%)、柠檬酸钠(99%)、醋酸(98%)、醋酸钠(99.5%)、过氧化氢、3,3′,5,5-四甲基联苯胺(TMB)(99%)、谷胱甘肽(GSH)(98%)、谷胱甘肽转移酶(GST)(阿拉丁试剂(上海)有限公司), 试剂均为分析纯,无任何纯化步骤.

    • 基于AgNO3还原法[18],将油浴锅加热至95 ℃,向油浴加热的烧瓶中加入50 mL甘油−水混合物(10 mL甘油+40 mL水),在1200 r/min的剧烈搅拌下,向溶液中添加9 mg AgNO3. 然后迅速向溶液中加入1 mL 3%柠檬酸钠溶液,在95 ℃下反应1 h后,自然冷却到室温,得到粒径为40 nm球形银溶液.

    • 取1.2 mL上述制备好的纳米银溶液和3.6 mL蒸馏水于10 mL离心管中. 将0.1 mol/L的氯金酸溶液稀释至3.75 mmol/L,然后移取1.2 mL氯金酸(3.75 mmol/L)分5次加入到上述溶液中,每次240 μL,每隔10 min加一次,直至加完. 由此得到HAuCl4刻蚀纳米银形成的球形Ag-Au纳米笼溶液,放置在4 ℃条件下备用.

    • 对于GSH的检测,通常将100 μL Ag-Au溶液、300 μL 5 mmol/L TMB、300 μL 5 mmol/L H2O2、300 μL HAc-NaAc(pH 3.6)混合均匀,并在室温下孵化30 min. 然后加入100 μL不同浓度的GSH溶液并在常温下反应5 min,在室温下记录 400~800 nm 处的紫外吸收光谱,记录652 nm 波长处的oxTMB的吸光度值. 以该值为纵坐标(y),GSH浓度c为横坐标(x)绘制标准曲线,用以测定样品GSH含量.

      对于GST的检测,分别将100 μL 900 μmol/L GSH溶液和100 μL不同浓度的GST溶液混合,在37 °C下孵化3 h. 然后向上述溶液再加入300 μL HAc-NaAc(pH 3.6)、300 μL 5 mmol·L−1 TMB、300 μL 5 mmol/L H2O2、100 μL Ag-Au溶液. 充分混合后反应10 min,记录 400~800 nm处的紫外吸收光谱,记录652 nm波长处的oxTMB的吸光度值. 以该值为纵坐标(y),GST质量浓度ρ为横坐标(x)绘制标准曲线,以此测定样品GST含量.

    • 图1,具有大表面积的球形Ag-Au纳米笼作为催化剂,催化TMB和H2O2反应,无色的TMB被氧化成蓝色的oxTMB,并在652 nm处观察到清晰的紫外吸收峰. 在Ag-Au纳米笼-TMB-H2O2体系中加入GSH后,652 nm处的吸光度降低,溶液颜色从蓝色变为浅蓝色,最后到无色. 这种现象是由于oxTMB被GSH还原所致[19]. 对于GST,它能够特异性结合GSH,因此,GST的加入将有效地抑制oxTMB被GSH还原,导致652 nm处的吸光度增加,溶液颜色从无色变为蓝色. 因此,可以通过652 nm处的oxTMB的吸光度和颜色的变化来测定GSH和GST的含量.

      图  1  利用Ag-Au纳米笼催化TMB-H2O2反应比色检测GSH和GST示意图

      Figure 1.  Schematic of colorimetric detection of GSH and GST based on TMB-H2O2 reaction catalyzed by Ag-Au nanocage

    • 图2,TEM(图2(a))和SEM(图2(c))图像显示了Ag-Au空心笼的纳米结构. HRTEM图像也清楚地显示了Au-Ag纳米笼的形成(图2(b)). 加入氯金酸前后形成的纳米Ag和Ag-Au纳米笼的UV-vis吸收光谱如图2(d)所示,随着氯金酸的加入,溶液的吸收峰从427 nm处红移到544 nm. 这些结果都证实了球形纳米银成功被氯金酸刻蚀,同时氯金酸还原后生成的纳米金沉积在刻蚀的纳米银表面形成Ag-Au纳米笼.

      图  2  Ag-Au纳米笼的纳米粒子表征

      Figure 2.  Characterization of nanoparticles in Ag-Au nanocages

    • 考察了不同浓度(0.25,0.5,0.75,1 mmol/L)氯金酸对Ag-Au 纳米笼的吸光度的影响(图3). 实验结果表明,随着氯金酸浓度的增加,溶液的吸光度先增大后减小. 当氯金酸浓度为0.75 mmol/L时,此时544 nm处的溶液吸光度达到最大,表明此浓度下的Ag-Au纳米粒子催化能力最强. 所以,0.75 mmol/L为氯金酸的最佳反应浓度. 考察了不同c(TMB)/c(H2O)(1∶1,1∶2,1∶10,1∶20,5∶1,10∶1)对溶液吸光度的影响. 如图4,当TMB为10 mmol/L,H2O2浓度为10 mmol/L时,652 nm处的吸光度接近最大,又鉴于如果H2O2过剩,过剩的H2O2将和GSH反应,故选用10 mmol/L TMB和10 mmol/L H2O2用于后续实验. 根据文献[20],当pH高于4时,Ag纳米粒子的催化效果会使H2O2会分解为H2O和O2,而不是OH自由基,故将pH控制在3.6左右. 因此,本实验选择pH 3.6的HAc-NaAc缓冲溶液.

      图  3  不同浓度氯金酸对Ag-Au纳米笼吸光度的影响

      Figure 3.  Effect of different concentrations of chloroauric acid on the absorbance of Ag-Au nanocages

      图  4  TMB/H2O2浓度比对oxTMB溶液吸光度的影响

      Figure 4.  Effect of TMB/H2O2 concentrations on the absorbance of oxTMB

    • 在最佳反应条件下,对不同浓度的GSH(终浓度:0,0.5,0.6,0.7,0.8,1.0,2.0 μmol/L)进行了定量检测,结果如图5所示. 无GSH存在时,Ag-Au纳米笼很容易催化TMB和H2O2反应,生成蓝色的oxTMB溶液,且在652 nm处存在出现很强的吸收峰;随着GSH浓度的增加,652 nm处的吸光度逐渐降低,相应地,溶液颜色从蓝色逐渐变为浅蓝,最终为无色(图5(a)内插图),表明oxTMB能被GSH还原. 而且,652 nm处的吸光度值随着GSH浓度的对数值增加而增加,在0.5~1.0 μmol/L范围内线性减小,其线性方程为y=−0.122−5.231x,相关系数R2为0.986(图5(b)),相对标准偏差(RSD)小于3.1%(n=3),表明此方法可用于定量检测GSH. 当GST被加入到Ag-Au纳米笼-TMB- H2O2-GSH溶液时,由于GST和GSH能特异性结合,导致652 nm处吸光度增加,溶液颜色由无色变成蓝色(图6(a)). GST在1~50 mg/L范围内时,GST溶液的质量浓度(x)对数值与其吸光度值(y)呈良好的线性关系,其线性方程为y=0.855+0.01x,相关系数R2为0.999(图6(b)),RSD小于2.8%(n=3),方法的检出限(3倍信噪比)为1 nmol/L. 以上说明该方法对GSH和GST检测具有较高的灵敏度和稳定性.

      图  5  最佳反应条件下不同浓度GSH溶液紫外检测光谱曲线

      Figure 5.  The UV detection spectra of GSH solutions with different concentrations under the optimal reaction conditions

      图  6  GST紫外检测光谱曲线

      Figure 6.  The UV detection spectra of GSH solutions

    • 选择5种常见物质(谷氨酸、半胱氨酸、组氨酸、葡萄糖和甘氨酸)作为干扰物质,并以2 μmol/L的浓度于上述最优反应条件下检测. 结果表明,除了GSH引起652 nm处吸光度值的明显改变,其它3种干扰物均不会出现响应. 然后分别在这5种干扰物−Ag-Au纳米笼−TMB−H2O2体系中加入1 mg/L GST,几乎未引起任何吸光度的变化. 这些结果表明该方法对GSH和GST有足够的特异性,这归因于GSH与oxTMB以及GSH和GST之间的特异性相互作用.

    • 通过检测新鲜人血清中的GSH和GST,研究了本文方法在生物环境中的传感性能. 将新鲜人血清稀释100倍,使GSH浓度在本实验的线性范围内. 为了测量回收率,分别添加不同含量的GSH和GST进行加标回收实验,结果见表1. 样品的平均回收率为95%~103.37%,RSD不大于5.6%,说明本方法可用于真实临床样本中的GSH和GST的检测.

      待检物未加标加标量检测结果RSD/%回收率/%
      GSH 0.42 μmol/L 0.2 μmol/L 0.59 μmol/L 3.7 95.16
      0.4 μmol/L 0.83 μmol/L 5.2 98.80
      0.5 μmol/L 0.89 μmol/L 3.3 103.37
      GST 1 mg/L 0.95 mg/L 5.6 95
      5 mg/L 5.06 mg/L 4.5 101.2

      表 1  血清样品中GSH和GST回收结果(n=3)

      Table 1.  Recovery results of GSH and GST in serum samples (n=3)

    • 建立了一种高灵敏和选择性的比色法用于GSH和GST的检测. Ag-Au纳米笼表现出类似过氧化物酶的活性,催化TMB和H2O2反应,伴随着蓝色oxTMB及652 nm处紫外吸收峰的形成. 为了提高检测体系的灵敏度,优化了TMB浓度、H2O2浓度、溶液pH值检测条件. 研究表明,当 TMB浓度为 5 mmol/L,H2O2浓度为 10 mmol/L,在pH 3.6的HAc-NaAc溶液里取得最优检测结果,且具有优异的选择性. 随着GSH浓度的增加,Ag-Au纳米笼的吸光度在0.5~1.0 μmol/L范围内呈线性减小;随着GST质量浓度的增加,Ag-Au纳米笼的吸光度在1~50 mg/L范围内呈线性增加.

参考文献 (20)

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