过表达RkHMGCR基因对红冬孢酵母类胡萝卜素合成的影响

和美霞 陈波 胡丽 张晓庆 季秀玲 魏云林 张琦

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过表达RkHMGCR基因对红冬孢酵母类胡萝卜素合成的影响

    作者简介: 和美霞(1996−),女,云南人,硕士生,主要研究微生物分子生物学. E-mail:1749115275@qq.com;
    通讯作者: 张琦, qzhang37@kust.edu.cn
  • 中图分类号: Q786

The effect of RkHMGCR over-expression on carotenoid producing in Rhodosporidium kratochvilovae

    Corresponding author: ZHANG Qi, qzhang37@kust.edu.cn
  • CLC number: Q786

  • 摘要: 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)是甲羟戊酸途径中的限速酶之一,其表达水平和催化活性会影响萜类及其衍生物的合成量. 研究从红冬孢酵母YM25235菌株中克隆到一个HMGCR基因,命名为RkHMGCR. 序列分析结果显示,RkHMGCR包含一个3 981 bp的开放阅读框,编码1326个氨基酸,其编码的氨基酸序列与已报道的HMGCR同样具有保守的2个底物结合位点、2个NADP(H)结合位点和与催化活性相关的4个关键氨基酸残基,表明RkHMGCR是一个潜在的新的HMGCR基因. 将RkHMGCR转回到YM25235菌株中进行过表达,分析结果显示,基因过表达使YM25235菌株中类胡萝卜素含量提高了42.21%,菌株中油脂和脂肪酸含量分别降低了28.93%和20.31%,这与部分类胡萝卜素合成和脂肪酸代谢相关基因的转录分析结果一致. 研究结果可为进一步通过代谢工程手段提高产油红酵母中类胡萝卜素及其特定组分含量的研究提供参考.
  • 图 1  RkHMGCR基因的PCR扩增

    Figure 1.  PCR Amplification of the gene RkHMGCR

    图 2  RkHMGCR与同源RkHMGCRs氨基酸序列比对

    Figure 2.  Alignment of amino acid sequence of RkHMGCR and homologous HMGCRs

    图 3  重组表达质粒pRHRkHMGCR的构建

    Figure 3.  Construction of recombination plasmid pRHRkHMGCR

    图 4  RkHMGCR基因过表达对YM25235菌株中类胡萝卜素合成和油脂代谢相关基因转录水平的影响

    Figure 4.  Effect of RkHMGCR overexpression on the transcription levels of genes involved with carotenoid biosynthesis and lipid metabolism

    表 1  YM25235菌株中不同基因的mRNA转录水平分析所用的引物

    Table 1.  Primers used for the analysis of mRNA levels in YM25235 strain

    引物名称引物序列目的基因
    RT- SSU rRNA -F 5′-CCATTCACTTACAAACACAA-3′ 核糖体RNA小亚基基因(SSU rRNA
    RT- SSU rRNA -R 5′-CACCACCAGATTCACTAA-3′
    RT-RkAcat2-F 5′-CCGAACATTATGGGCATC-3′ 乙酰辅酶A硫解酶基因(RkAcat2
    RT-RkAcat2-R 5′-CGATGTCCTCAATCTTCAT-3′
    RT-RkHMGCS-F 5′-AGACGCTCATCGACAAGA-3′ 3-羟基-3-甲基戊二酸甲酰CoA合成酶基因(RkHMGCS
    RT-RkHMGCS-R 5′-CCTCAATGTCCGAGTTGC-3′
    RT-RkHMGCR-F 5′-CATTGTCACCGTCTTCTG-3′ 3-羟基-3-甲基戊二酸甲酰CoA还原酶基因(RkHMGCR
    RT-RkHMGCR-R 5′-GTCGTCGTAGAGGAGGAA-3′
    RT-RkCrtYB-F 5′-GTTCTTCTTGTGGGAGTG-3′ 八氢番茄红素合成酶和番茄红素环化酶基因(RkCrtYB
    RT-RkCrtYB-R 5′-CCGCTTCTTCAATCTCAA-3′
    RT-RkCrtI-F 5′-GAGAAGGGTTTCGAGGGCTT-3′ 八氢番茄红素脱氢酶基因(RkCrtI
    RT-RkCrtI-R 5′-ATGGAGAGGAGCGAGGTGAA-3′
    RT-RkFAS1-F 5′-ACACTACAACGAGAAGGCCG-3′ 脂肪酸合成酶基因(RkFAS1
    RT-RkFAS1-R 5′-CGCTGGTTGATGTAGAGGCA-3′
    RT-RkACOX2-F 5′-ATTCACGACCTCACCAAGGC-3′ 乙酰基辅酶A氧化酶基因(RkACOX2
    RT-RkACOX2-R 5′-CACTCCATATCGCGTCCAGA-3′
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    表 2  过表达RkHMGCR基因对YM25235菌株中类总胡萝卜素质量比及其组分质量比的影响

    Table 2.  Effect of RkHMGCR overexpression on the content of total carotenoid and its compositions in YM25235

    样品w(类胡萝卜素)/(mg·g−1w(总类胡萝卜素)/(mg·g−1
    圆红酵母素红酵母红素γ-胡萝卜素β-胡萝卜素
    YM252350.46±0.261.04±0.021.43±0.182.79±0.285.71±0.03
    YM25235/pRHRkHMGCR1.31±0.06*1.56±0.070.67±0.16*4.58±0.08**8.12±0.09**
    表中数据为3次独立实验的平均值±标准差. 重组菌株与对照菌株之间进行t检验,*表示p <0.05,**表示p<0.01.
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    表 3  RkHMGCR基因过表达对YM25235菌株油脂质量分数的影响

    Table 3.  Effect of RkHMGCR overexpression on the lipid content in YM25235

    菌株油脂w/%
    YM252354.84±0.12
    YM25235/pRHRkHMGCR3.44±0.12*
    表中数据为3次独立实验平均值±标准差. 重组菌株与对照菌株之间进行t检验,*表示p <0.05.
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    表 4  RkHMGCR基因过表达对YM25235菌株脂肪酸组分质量分数的影响

    Table 4.  Effect of RkHMGCR overexpression on the content of fatty acid compositions in YM25235

    样品脂肪酸组分w/%
    C17∶0C16∶0C16∶1C18∶0C18∶1OAC18∶2 LAC18∶3 ALA
    YM2523521.91±.0.7314.21±0.681.52±0.072.33±0.2742.05±1.0714.20±1.011.41±0.42
    YM25235/pRHRkHMGCR26.36±1.13*12.17±0.951.45±0.230.98±0.5338.32±1.74*16.03±0.642.02±0.57
    表中数据为3次独立实验的平均值±标准差. 重组菌株与对照菌株之间进行t 检验,*表示p <0.05.
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  • [1] Mata-Gómez L C, Montañez J C, Méndez-Zavala A, et al. Biotechnological production of carotenoids by yeasts: an overview[J]. Microbial Cell Factories, 2014, 13(1): 12. DOI:  10.1186/1475-2859-13-12.
    [2] Kong K W, Khoo H E, Prasad K N, et al. Revealing the power of the natural red pigment lycopene[J]. Molecules, 2010, 15(2): 959-987. DOI:  10.3390/molecules15020959.
    [3] Rao A V, Agarwal S. Role of lycopene as antioxidant carotenoid in the prevention of chronic diseases: A review[J]. Nutrition Research, 1999, 19(2): 305-323. DOI:  10.1016/S0271-5317(98)00193-6.
    [4] Rao A V, Agarwal S. Role of antioxidant lycopene in cancer and heart disease[J]. Journal of the American College of Nutrition, 2000, 19(5): 563-569. DOI:  10.1080/07315724.2000.10718953.
    [5] Mein J R, Lian F, Wang X D. Biological activity of lycopene metabolites: Implications for cancer prevention[J]. Nutrition Reviews, 2008, 66(12): 667-683. DOI:  10.1111/j.1753-4887.2008.00120.x.
    [6] Li C, Swofford C A, Sinskey A J. Modular engineering for microbial production of carotenoids[J]. Metab Eng Commun, 2019, 10: e00118. DOI:  10.1016/j.mec.2019.e00118.
    [7] Nagy G, Vaz A G, Szebenyi C, et al. CRISPR-Cas9-mediated disruption of the HMG-CoA reductase genes of Mucor circinelloides and subcellular localization of the encoded enzymes[J]. Fungal Genetics and Biology, 2019, 129: 30-39. DOI:  10.1016/j.fgb.2019.04.008.
    [8] Yan G L, Wen K R, Duan C Q. Enhancement of beta-carotene production by over-expression of HMG-CoA reductase coupled with addition of ergosterol biosynthesis inhibitors in recombinant Saccharomyces cerevisiae[J]. Current Microbiology, 2012, 64(2): 159-163. DOI:  10.1007/s00284-011-0044-9.
    [9] Bochar D A, Stauffacher C V, Rodwell V W. Sequence comparisons reveal two classes of 3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase[J]. Molecular Genetics and Metabolism, 1999, 66(2): 122-127. DOI:  10.1006/mgme.1998.2786.
    [10] Istvan ES. Bacterial and mammalian HMG-CoA reductases: Related enzymes with distinct architectures[J]. Current Opinion in Structural Biology, 2001, 11(6): 746-751. DOI:  10.1016/s0959-440x(01)00276-7.
    [11] 李嵘, 王喆之. 植物萜类合成酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的生物信息学分析[J]. 广西植物, 2006, 26(5): 464-473. DOI:  10.3969/j.issn.1000-3142.2006.05.002. Li R, Wang Z Z. A bioinformatics analysis on 3-hydroxy-3-methylglutaryle-CoA reductase, a key enzyme in plant isoprenoid biosynthesis[J]. Guihaia, 2006, 26(5): 464-473.
    [12] Goldstein J L, Brown M S. Regulation of the mevalonate pathway[J]. Nature, 1990, 343(6257): 425-430. DOI:  10.1038/343425a0.
    [13] Istvan E S, Palnitkar M, Buchanan S K, et al. Crystal structure of the catalytic portion of human HMG-CoA reductase: insights into regulation of activity and catalysis[J]. The EMBO Journal, 2000, 19(5): 819-830. DOI:  10.1093/emboj/19.5.819.
    [14] Hampton R, Dimster-Denk D, Rine J. The biology of HMG-CoA reductase: The pros of contra-regulation[J]. Trends in Biochemical Sciences, 1996, 21(4): 140-145. DOI:  10.1016/S0968-0004(96)80168-X.
    [15] Ward V C A, Chatzivasileiou A O, Stephanopoulos G. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of isoprenoids[J]. FEMS Microbiology Letters, 2018, 365(10). DOI:  10.1093/femsle/fny079.
    [16] Mannazzu I, Landolfo S, Lopes da Silva T, et al. Red yeasts and carotenoid production: outlining a future for non-conventional yeasts of biotechnological interest[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2015, 31(11): 1 665-1 673. DOI:  10.1007/s11274-015-1927-x.
    [17] 罗敏周, 杨晓霞, 季秀玲, 等. 红冬孢酵母Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达[J]. 云南大学学报: 自然科学版, 2016, 38(4): 669-675. DOI:  10.7540/j.ynu.20150418. Luo M Z, Yang X X, Ji X L, et al. Cloning and expression of a Δ12-desaturase gene from Rhodosporidium kratochvilovae[J]. Journal of Yunnan University: Natural Sciences Edition, 2016, 38(4): 669-675.
    [18] Buzzini P, Innocenti M, Turchetti B, et al. Carotenoid profiles of yeasts belonging to the genera Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces, and Sporidiobolus[J]. Canadian Journal of Microbiology, 2007, 53(8): 1 024-1 031. DOI:  10.1139/W07-068.
    [19] Davoli P, Mierau V, Weber R W. Carotenoids and fatty acids in red yeasts Sporobolomyces roseus and Rhodotorula glutinis[J]. Applied Biochemistry and Microbiology, 2004, 40(4): 460-465.
    [20] Liu H, Jiao X, Wang Y, et al. Fast and efficient genetic transformation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides by using electroporation[J]. FEMS Yeast Research, 2017, 17(2): 10. DOI:  10.1093/femsyr/fox017.
    [21] 杨万政, 曹秀君, 李金淑, 等. 紫外分光光度法测定沙棘油中总类胡萝卜素方法改进[J]. 中央民族大学学报: 自然科学版, 2009, 18(3): 5-8. Yang W Z, Cao X J, Li J S, et al. Improvement of determination of total carotenoids in seabuckthorn oil by UV spectrophotometry[J]. Journal of Minzu University of China: Natural Sciences Edition, 2009, 18(3): 5-8.
    [22] 魏娜, 徐琼, 张宁, 等. 掷孢酵母类胡萝卜素的提取与鉴定[J]. 食品科学, 2014, 35(19): 133-137. DOI:  10.7506/spkx1002-6630-201419028. Wei N, Xu Q, Zhang N, et al. Extraction and identification of carotenoids in Spowbolomyces parawseus[J]. Food Science, 2014, 35(19): 133-137.
    [23] Cui J, He S, Ji X, et al. Identification and characterization of a novel bifunctional Δ(12)/Δ(15)-fatty acid desaturase gene from Rhodosporidium kratochvilovae[J]. Biotechnol Lett, 2016, 38(7): 1 155-1 164. DOI:  10.1007/s10529-016-2090-7.
    [24] Pöggeler S, Nowrousian M, Ringelberg C, et al. Microarray and real-time PCR analyses reveal mating type-dependent gene expression in a homothallic fungus[J]. Mol Genet Genomics, 2006, 275(5): 492-503. DOI:  10.1007/s00438-006-0107-y.
    [25] Istvan E S, Deisenhofer J. The structure of the catalytic portion of human HMG-CoA reductase[J]. Biochim Biophys Acta, 2000, 1529(1/3): 9-18. DOI:  10.1016/s1388-1981(00)00134-7.
    [26] Ukibe K, Hashida K, Yoshida N, et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for astaxanthin production and oxidative stress tolerance[J]. Appl Environ Microbiol, 2009, 75(22): 7 205-7 211. DOI:  10.1128/AEM.01249-09.
    [27] Shimada H, Kondo K, Fraser P D, et al. Increased carotenoid production by the food yeast Candida utilis through metabolic engineering of the isoprenoid pathway[J]. Appl Environ Microbiol, 1998, 64(7): 2 676-2 680. DOI:  10.1128/AEM.64.7.2676-2680.1998.
    [28] Wang G Y, Keasling J D. Amplification of HMG-CoA reductase production enhances carotenoid accumulation in Neurospora crassa[J]. Metab Eng, 2002, 4(3): 193-201. DOI:  10.1006/mben.2002.0225.
    [29] Hara K Y, Morita T, Mochizuki M, et al. Development of a multi-gene expression system in Xanthophyllomyces dendrorhous[J]. Microb Cell Fact, 2014, 13(1): 175. DOI:  10.1186/s12934-014-0175-3.
    [30] Martinez-Moya P, Niehaus K, Alcaíno J, et al. Proteomic and metabolomic analysis of the carotenogenic yeast Xanthophyllomyces dendrorhous using different carbon sources[J]. BMC Genomics, 2015, 16(1): 289. DOI:  10.1186/s12864-015-1484-6.
    [31] Pan X, Wang B, Gerken H G, et al. Proteomic analysis of astaxanthin biosynthesis in Xanthophyllomyces dendrorhous in response to low carbon levels[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2017, 40(7): 1 091-1 100. DOI:  10.1007/s00449-017-1771-5.
    [32] Tkáčová J, Klempová T, Čertík M. Kinetic study of growth, lipid and carotenoid formation in β-carotene producing Rhodotorula glutinis[J]. Chemical Papers, 2018, 72(5): 1 193-1 203. DOI:  10.1007/s11696-017-0368-4.
    [33] Tkáčová J, Čaplová J, Klempová T, et al. Correlation between lipid and carotenoid synthesis in torularhodin-producing Rhodotorula glutinis[J]. Annals of Microbiology, 2017, 67(8): 541-551. DOI:  10.1007/s13213-017-1284-0.
    [34] Saini R K, Keum Y S. Progress in microbial carotenoids production[J]. Indian J Microbiol, 2017, 57(1): 129-130. DOI:  10.1007/s12088-016-0637-x.
    [35] Kot AM, Błażejak S, Kurcz A, et al. Rhodotorula glutinis—potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2016, 100(14): 6 103-6 117. DOI:  10.1007/s00253-016-7611-8.
  • [1] 罗敏周杨晓霞季秀玲林连兵魏云林张琦 . 红冬孢酵母Δ12-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达. 云南大学学报(自然科学版), 2016, 38(4): 669-675. doi: 10.7540/j.ynu.20150418
    [2] 何仕武杨昭杰林连兵季秀玲魏云林张琦 . 多不饱和脂肪酸与红冬孢酵母低温适应性的关系研究. 云南大学学报(自然科学版), 2014, 36(4): 594-599. doi: 10.7540/j.ynu.20130510
    [3] 丁丽娜胡彬彬林连兵季秀玲魏云林张琦 . 深黄被孢霉Δ12-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达载体的构建. 云南大学学报(自然科学版), 2012, 34(2): 242-248.
    [4] 罗蕾张吕丽李祖强曲云峰杨亚丹马国义 . 羊脆木的化学成分研究(Ⅱ). 云南大学学报(自然科学版), 2014, 36(6): 903-906. doi: 10.7540/j.ynu.20140330
    [5] 高珏肖红卫古昆 . 橡胶籽油中多价不饱和脂肪酸分离技术研究——尿素包合法分离多价不饱和脂肪酸甲酯. 云南大学学报(自然科学版), 2002, 24(4): 309-311.
    [6] 宋建红徐杨斌张小辉包桂蓉李法社 . 脂肪酸甲酯对生物柴油氧化性能和热值的影响. 云南大学学报(自然科学版), 2017, 39(5): 862-868. doi: 10.7540/j.ynu.20160715
    [7] 张琦苗翠苹李明春李绍兰李志滢邢来君陈有为 . Δ6-脂肪酸脱氢酶的系统进化分析. 云南大学学报(自然科学版), 2006, 28(5): 450-455,460.
    [8] 李援亚曾黎琼王力张云孙 . 水稻基因表达谱分析寡核苷酸芯片制备的研究. 云南大学学报(自然科学版), 2007, 29(5): 515-518.
    [9] 杨晓霞何仕武赵汝丽魏云林林连兵季秀玲张琦 . mRNA差异显示技术研究低温条件下深黄被孢霉基因的表达差异. 云南大学学报(自然科学版), 2015, 37(2): 317-322. doi: 10.7540/j.ynu.20140499
    [10] 王金萍宋建领张文东李作生冯子良胡媛媛郭松辉张应国范泉水宋学林邱薇张富强 . H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆与表达. 云南大学学报(自然科学版), 2007, 29(6): 623-627.
    [11] 袁志栋王志亮刘雨田吴晓东刘海生 . 水貂朊蛋白前体基因的原核表达. 云南大学学报(自然科学版), 2005, 27(2): 180-184.
    [12] 吴拥军赵德刚宋莉许文钊 . ChIFN-γ基因植物表达载体的构建与瞬时表达. 云南大学学报(自然科学版), 2008, 30(6): 630-635.
    [13] 闵文文梅 端代婷婷胡光华 . 基于遗传算法SVM的基因表达谱数据分析. 云南大学学报(自然科学版), 2013, 35(4): 441-446. doi: 10.7540/j.ynu.20120663
    [14] 陈丹李慧敏张静梁振霞 . 果蝇胚胎不同表达水平基因内含子序列特征的比较分析. 云南大学学报(自然科学版), 2013, 35(2): 254-260. doi: 10.7540/j.ynu.20120435
    [15] 罗淋淋蔡紫玲许雯林同 . 松墨天牛原肌球蛋白基因的克隆和表达检测. 云南大学学报(自然科学版), 2015, 37(3): 445-451. doi: 10.7540/j.ynu.20140631
    [16] 袁方陈元晓StephanieDawesEdwardN.Baker . 结核分枝杆菌H37Ra FadD3基因克隆与表达研究. 云南大学学报(自然科学版), 2014, 36(4): 600-605. doi: 10.7540/j.ynu.20140040
    [17] 奎翔李鸿钧谢天宏张光明刘馨易山杨芳彭梅马开利孙茂盛 . 甲/戊型肝炎病毒重组抗原基因的克隆及表达. 云南大学学报(自然科学版), 2008, 30(2): 202-206.
    [18] 崔畅范志祥钱忠义白娟娟王乐龙莉 . ATF3基因在正常小鼠脑组织中的表达定位研究. 云南大学学报(自然科学版), 2018, 40(4): 814-819. doi: 10.7540/j.ynu.20170794
    [19] 罗兰李水冰余敏谭德勇 . 小鼠睾丸发育过程中Si1基因表达的研究. 云南大学学报(自然科学版), 2007, 29(2): 208-212.
    [20] 代茹冀敏舒小梅陈尚武张文马会勤 . 葡萄愈伤组织RNA提取方法比较及部分基因的表达差异初步分析. 云南大学学报(自然科学版), 2009, 31(4): 410-415 .
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-11-23
  • 录用日期:  2021-01-28
  • 网络出版日期:  2021-04-02
  • 刊出日期:  2021-09-15

过表达RkHMGCR基因对红冬孢酵母类胡萝卜素合成的影响

    作者简介:和美霞(1996−),女,云南人,硕士生,主要研究微生物分子生物学. E-mail:1749115275@qq.com
    通讯作者: 张琦, qzhang37@kust.edu.cn
  • 昆明理工大学 生命科学与技术学院,云南 昆明 650500

摘要: 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)是甲羟戊酸途径中的限速酶之一,其表达水平和催化活性会影响萜类及其衍生物的合成量. 研究从红冬孢酵母YM25235菌株中克隆到一个HMGCR基因,命名为RkHMGCR. 序列分析结果显示,RkHMGCR包含一个3 981 bp的开放阅读框,编码1326个氨基酸,其编码的氨基酸序列与已报道的HMGCR同样具有保守的2个底物结合位点、2个NADP(H)结合位点和与催化活性相关的4个关键氨基酸残基,表明RkHMGCR是一个潜在的新的HMGCR基因. 将RkHMGCR转回到YM25235菌株中进行过表达,分析结果显示,基因过表达使YM25235菌株中类胡萝卜素含量提高了42.21%,菌株中油脂和脂肪酸含量分别降低了28.93%和20.31%,这与部分类胡萝卜素合成和脂肪酸代谢相关基因的转录分析结果一致. 研究结果可为进一步通过代谢工程手段提高产油红酵母中类胡萝卜素及其特定组分含量的研究提供参考.

English Abstract

  • 类胡萝卜素(carotenoid)是一类重要脂溶性色素的总称,是由异戊二烯骨架构成的C40或C30萜类化合物,其广泛存在于植物、细菌、真菌和藻类中. 类胡萝卜素是人体内维生素A的前体,但人和动物不能自身合成,摄入类胡萝卜素可提高人体免疫力[1]. 此外,类胡萝卜素还具有着色、抗氧化、抗凋亡和抗癌作用[2-5]. 类胡萝卜素是以乙酰CoA作为底物,经甲羟戊酸(mevalonate,MVA)途径合成焦磷酸异戊烯基(isopentenylpyrophosphate,IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP),二者经浓缩并经不同反应过程进一步转化为番茄红素、β-胡萝卜素等不同类胡萝卜素[6]. 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGCR)催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)生成MVA,是MVA合成途径中的限速酶,也是异戊二烯生物合成途径的第一个关键酶,对于类胡萝卜素和麦角固醇等异戊二烯衍生物的生物合成有着重要作用[7-8].

    HMGCR广泛存在真核生物、原核生物和古细菌中,是一种高度保守的膜结合酶[9]. 根据氨基酸序列的差异,HMGCR可以分为Ⅰ类和Ⅱ类,真核生物和古菌的HMGCR属于Ⅰ类,其利用NADPH作为电子供体,而细菌的HMGCR属于Ⅱ类并利用NADH作为电子供体[10-12]. 真核生物HMGCRs在氨基酸序列上存在很大差异,但一些关键位点如底物结合位点TTEGALVA和ENVIGX3I/LP,NADPH结合位点DAMGMNMIS和GTVGGGT,以及与催化活性相关的4个关键氨基酸残基Glu、Lys、Asp和His却高度保守[13-14]. 研究还表明,Ⅰ类HMGCR的N末端具有参与甾醇感应、蛋白泛素化降解调节和催化反应的多种跨膜结构域,且该结构域在每种物种中种类和个数不同,而且序列变化很大[9,13-14].

    目前,商业化的类胡萝卜素来源主要是通过化学合成获得,少量是从植物提取和微生物发酵生产的天然类胡萝卜素. 化学合成的类胡萝卜素虽然具有天然类胡萝卜素类似的分子结构,但天然类胡萝卜素更有利于健康,因此人们对其需求也日益增加[1]. 近年来通过代谢工程研究使微生物高效益、低成本生产类胡萝卜素逐渐成为有希望的替代途径[15],而且产油红酵母由于保持产油酵母发酵上的优势并能持续提供乙酰CoA合成类胡萝卜素和油脂等各种衍生物的优点逐渐成为研究热点[16]. 红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235是一株分离自云南程海的产油红酵母菌株[17],和很多红酵母一样,YM25235菌株也主要合成圆酵母素(torulene)、红酵母红素(torularhodin)、γ-胡萝卜素(γ-carotene)、β-胡萝卜素(β-carotene)等4种类胡萝卜素[18-19]. 因此,本研究拟从YM25235菌株中克隆HMGCR基因RkHMGCR,并将其转回YM25235菌株中进行过表达,以提高YM25235菌株产类胡萝卜素的水平,为进一步筛选类胡萝卜素高产菌株和工艺化生产类胡萝卜素的研究与应用打下基础.

    • 红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235菌株由云南大学微生物研究所李绍兰研究员惠赠,大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α由本研究室保存,质粒pMD-18T购自宝生物工程(大连)有限公司,表达载体pRH2034购自新加坡民族大学.

    • DNA纯化回收试剂盒购自北京百泰克生物有限公司,质粒提取试剂盒购自Omega公司,酵母基因组DNA和RNA提取试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司,限制性内切酶购自Thermo 公司,高保真DNA聚合酶购自南京诺维赞生物有限公司,高效液相所用试剂为色谱纯,其他试剂均为国产分析纯.

    • 根据转录组测序获得的RkHMGCR基因的蛋白质编码序列设计并合成引物对:上游引物RkHMGCR-F:5′-TTCGGATCCTTATGGTCCTCTCGCCGTC-3′和下游引物RkHMGCR-R:5′-GCAGATATCTTACTCTTTGGCGAACCCG-3′(下划线分别为BamH Ⅰ和EcoR Ⅴ位点),以提取自YM25235菌株的总RNA反转录的cDNA作为模板进行PCR扩增. 扩增条件为:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s、63 ℃退火30 s、72 ℃延伸4 min,进行30个循环,最后72 ℃延伸10 min. 扩增的PCR产物经纯化回收后与pMD-18T载体连接,经蓝白斑筛选和菌落PCR验证后,挑取阳性克隆送出测序. 进一步根据测序所得的目的序列,利用NCBI网站的BLASTp程序进行同源序列比对,同时参考已报道的HMGCR序列分析结果,利用NCBI上Conserved Domain程序进行蛋白质序列结构域预测.

    • BamH Ⅰ和EcoR Ⅴ对连接有基因RkHMGCR的pMD-18T载体和表达载体pRH2034 进行双酶切,电泳回收目的片段后用T4连接酶连接,并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中. 通过菌落PCR和提取质粒进行双酶切鉴定来筛选阳性克隆,然后进一步将重组质粒送出进行测序验证,所构建的重组表达质粒命名为pRHRkHMGCR.

    • 将重组质粒pRHRkHMGCR通过电击转化法[20]转入YM25235中,通过含150 μg/mL潮霉素B的YPD固体培养基筛选得到抗性转化子. 利用酵母基因组提取试剂盒提取抗性转化子的基因组DNA,以此为模板通过PCR进行阳性克隆验证获得HMGCR基因转化成功的转化子. 将PCR验证正确的阳性克隆于50 mL YPD液体培养基中培养至192 h,离心收集菌体,冷冻干燥后磨成粉. 取0.4 g干菌体使用丙酮进行多次提取后,合并提取液. 然后参考文献[21]的方法,利用紫外分光光度计在450 nm处测定吸光度并计算总类胡萝卜素含量. 经多次筛选后得到高产类胡萝卜素的转化子,命名为YM25235/pRHRkHMGCR.

    • 以YM25235菌株为对照,按上述方法分别提取YM25235菌株和转基因菌株YM25235/pRHRkHMGCR的总类胡萝卜素,分析YM25235/pRHRkHMGCR菌株中总类胡萝卜素的质量比变化情况. 进一步通过高效液相色谱法(HPLC)对总类胡萝卜素的4种主要成分的质量比变化进行检测分析,HPLC分析条件参照魏娜等[22]的方法,液相色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(ϕ4.6 mm×250 mm,5 μm).

    • 取上述干菌粉0.3 g(m0),加入1.8 mL 4 mol/L的盐酸溶液,充分混匀后室温放置30 min,再沸水浴3 min后取出将其冷却,待冷却到室温后,加入V(氯仿)∶V(甲醇)=2的混合液,充分混匀后于8000 r/min离心5 min. 收集底层的氯仿层,加入与氯仿层等体积的0.1% NaCl溶液,震荡混匀,在5000 r/min下离心5 min,取底层的氯仿层于干净干燥的玻璃平皿中(皿质量m1),将平皿置于通风橱中挥发除去氯仿,得到油脂,干燥至平皿的重量恒定,称量(m2). 按照以下公式计算:油脂质量分数(%)= $ \dfrac{m_2-m_1}{m_0}\times 100\% $.

    • 参考文献[23]检测YM25235和YM25235/pRHRkHMGCR菌株中脂肪酸的含量变化. 称取上述干菌粉0.1 g,加入2.5 mL 10% KOH甲醇溶液和2.5 mL 0.6 mg/mL C17内标物提取脂肪酸,并与70 ℃下皂化4.5 h. 然后用浓盐酸将样品的pH调至2.0,加入4 mL 14%三氟化硼乙醚,继续在70 ℃水浴1.5 h,使脂肪酸甲酯化. 最后用正己烷萃取脂肪酸甲酯,并用气相色谱−质谱(GC-MS)进行分析.

    • 取发酵培养96 h的酵母细胞,提取总RNA并反转录合成cDNA,以YM25235菌株样品作为对照,通过实时荧光定量PCR方法检测RkHMGCR基因过表达对类胡萝卜素合成和油脂代谢相关基因转录水平的变化. 以小亚基rRNA(SSU rRNA)基因作为内参,通过 2−△△CT[24]分析不同基因的相对转录水平. 实时荧光定量PCR分析所用引物如表1所示.

      引物名称引物序列目的基因
      RT- SSU rRNA -F 5′-CCATTCACTTACAAACACAA-3′ 核糖体RNA小亚基基因(SSU rRNA
      RT- SSU rRNA -R 5′-CACCACCAGATTCACTAA-3′
      RT-RkAcat2-F 5′-CCGAACATTATGGGCATC-3′ 乙酰辅酶A硫解酶基因(RkAcat2
      RT-RkAcat2-R 5′-CGATGTCCTCAATCTTCAT-3′
      RT-RkHMGCS-F 5′-AGACGCTCATCGACAAGA-3′ 3-羟基-3-甲基戊二酸甲酰CoA合成酶基因(RkHMGCS
      RT-RkHMGCS-R 5′-CCTCAATGTCCGAGTTGC-3′
      RT-RkHMGCR-F 5′-CATTGTCACCGTCTTCTG-3′ 3-羟基-3-甲基戊二酸甲酰CoA还原酶基因(RkHMGCR
      RT-RkHMGCR-R 5′-GTCGTCGTAGAGGAGGAA-3′
      RT-RkCrtYB-F 5′-GTTCTTCTTGTGGGAGTG-3′ 八氢番茄红素合成酶和番茄红素环化酶基因(RkCrtYB
      RT-RkCrtYB-R 5′-CCGCTTCTTCAATCTCAA-3′
      RT-RkCrtI-F 5′-GAGAAGGGTTTCGAGGGCTT-3′ 八氢番茄红素脱氢酶基因(RkCrtI
      RT-RkCrtI-R 5′-ATGGAGAGGAGCGAGGTGAA-3′
      RT-RkFAS1-F 5′-ACACTACAACGAGAAGGCCG-3′ 脂肪酸合成酶基因(RkFAS1
      RT-RkFAS1-R 5′-CGCTGGTTGATGTAGAGGCA-3′
      RT-RkACOX2-F 5′-ATTCACGACCTCACCAAGGC-3′ 乙酰基辅酶A氧化酶基因(RkACOX2
      RT-RkACOX2-R 5′-CACTCCATATCGCGTCCAGA-3′

      表 1  YM25235菌株中不同基因的mRNA转录水平分析所用的引物

      Table 1.  Primers used for the analysis of mRNA levels in YM25235 strain

    • 以红冬孢酵母YM25235的 cDNA为模板,通过PCR扩增,获得一个大小约为4 000 bp的片段(图1),将其命名为RkHMGCR. 回收获得该片段,进一步将其连接到PMD-18T载体上并送出测序. 测序结果显示RkHMGCR基因片段长为3 981 bp,编码1 326个氨基酸,预测其编码的蛋白质相对分子质量(Mr)为145.68 ku.

      图  1  RkHMGCR基因的PCR扩增

      Figure 1.  PCR Amplification of the gene RkHMGCR

    • 相似性搜索表明,RkHMGCR编码的氨基酸序列(GenBank登录号:MW448479)与酵母来源的HMGCR的氨基酸序列相似性最大,其中与圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)NP11来源 RtHMGCR(GenBank登录号:XP_016270872)、红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)XdHMGCR酶(GenBank登录号:CED85502)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C的ScHMGCR酶(GeneBank登录号:NP_013636)的相似性分别为81.94%、35.63%和23.61%. 序列比对分析结果还表明,所编码的氨基酸序列和已知的HMGCR酶类似,具有特异性的4个氨基酸保守区[14,25]:2个底物结合位点TTEGALVA(氨基酸位点为970~977)和ENVVGYMPLP(氨基酸位点为941~950),2个NADP(H)结合位点DAMGMNMIS(氨基酸位点为1 065~1 073)和GTVGGGT(氨基酸位点1 214~1 220),以及4 个催化活性中心关键的氨基酸残基 Glu、Lys、Asp、His(其氨基酸位点分别为 972、1 105、1 181、1 279)(图2). 此外,氨基酸序列比对分析也显示,除了具有4个结合位点和关键氨基酸残基的氨基酸序列保守性高外,其余氨基酸序列在不同来源HMGCS中变化较大(N端序列长,结果未提供),与已报道分析结果[13-14]一致. 这些结果表明所获得的cDNA序列是一个新的潜在HMGCR基因编码序列.

      图  2  RkHMGCR与同源RkHMGCRs氨基酸序列比对

      Figure 2.  Alignment of amino acid sequence of RkHMGCR and homologous HMGCRs

    • 首先通过双酶切连接将RkHMGCR从PMD18-T切下并插入到表达载体pRH2034的BamH Ⅰ和EcoR Ⅴ 位点之间构建重组质粒pRHRkHMGCR(图3(a)). 然后对其重组质粒进行双酶切验证分析,结果如图3(b)所示,结果表明重组质粒pRHRkHMGCR 酶切产生4 kb和10.7 kb 两条带(图 3(b) 第 4 泳道),这两个条带分别与目的基因 RkHMGCR 扩增片段(图 3(b) 第 5 泳道)和空载体 pRH2034 双酶切后(图3(b) 第 3 泳道)的大小一致. 同时,测序结果也表明所获得片段与目的序列一致,证明重组质粒构建成功.

      图  3  重组表达质粒pRHRkHMGCR的构建

      Figure 3.  Construction of recombination plasmid pRHRkHMGCR

    • 总类胡萝卜素含量分析结果表明,过表达菌株YM25235/pRHRkHMGCR中的总类胡萝卜素质量比为8.12 mg/g,相较于对照菌株YM25235(5.71 mg/g)提高了42.21%(表2). 进一步通过HPLC分析总类胡萝卜素中4种不同组分含量变化,结果显示,过表达菌株YM25235/pRHRkHMGCR中圆酵母素、红酵母红素、β-胡萝卜素的均显著提高,但γ-胡萝卜素含量反而下降. 其中β-胡萝卜素含量提高最为显著,达4.58 mg/g DCW,占总类胡萝卜素含量的56.40%,相较于对照(48.86%)β-胡萝卜素含量在总类胡萝卜素含量中明显提高. 这些结果表明,过表达RkHMGCR基因能显著提高YM25235菌株中总类胡萝卜素及β-胡萝卜素含量.

      样品w(类胡萝卜素)/(mg·g−1w(总类胡萝卜素)/(mg·g−1
      圆红酵母素红酵母红素γ-胡萝卜素β-胡萝卜素
      YM252350.46±0.261.04±0.021.43±0.182.79±0.285.71±0.03
      YM25235/pRHRkHMGCR1.31±0.06*1.56±0.070.67±0.16*4.58±0.08**8.12±0.09**
      表中数据为3次独立实验的平均值±标准差. 重组菌株与对照菌株之间进行t检验,*表示p <0.05,**表示p<0.01.

      表 2  过表达RkHMGCR基因对YM25235菌株中类总胡萝卜素质量比及其组分质量比的影响

      Table 2.  Effect of RkHMGCR overexpression on the content of total carotenoid and its compositions in YM25235

    • 类胡萝卜素合成与油脂合成都是以乙酰CoA作为共同前体. 在本研究中,过表达RkHMGCR基因提高了YM25235中类胡萝卜素的质量比,在此基础上,我们进一步测定对照菌株YM25235和过表达菌株YM25235/pRHRkHMGCR的油脂质量比. 结果如表3所示,过表达菌株YM25235/pRHRkHMGCR中油脂质量比约为3.44%,较对照菌株YM25235(4.84% DCW)降低了28.93%. 表明过表达RkHMGCR基因会减少YM25235中油脂的积累.

      菌株油脂w/%
      YM252354.84±0.12
      YM25235/pRHRkHMGCR3.44±0.12*
      表中数据为3次独立实验平均值±标准差. 重组菌株与对照菌株之间进行t检验,*表示p <0.05.

      表 3  RkHMGCR基因过表达对YM25235菌株油脂质量分数的影响

      Table 3.  Effect of RkHMGCR overexpression on the lipid content in YM25235

    • 为探究过表达RkHMGCR基因对YM25235中脂肪酸含量的影响,我们提取对照菌株YM25235和过表达菌株YM25235/pRHRkHMGCR的总脂肪酸并进行GC-MS分析. 结果如表4所示,过表达菌株YM25235/pRHRkHMGCR中总脂肪酸质量分数下降约20.31%,其中棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)和亚油酸(oleic acid,OA,C18∶1)的质量分数略有下降,而多不饱和脂肪酸亚油酸(linoleic acid,LA,C18∶2)和α-亚麻酸(α-linolenic acid,ALA,C18∶3)的含量却有所增加. 该结果表明,RkHMGCR基因过表达促进YM25235中脂肪酸的降解,可能提供了更多的乙酰CoA进入类胡萝卜素合成途径,促进类胡萝卜素合成,同时上述油脂累积的降低也证明了这一观点.

      样品脂肪酸组分w/%
      C17∶0C16∶0C16∶1C18∶0C18∶1OAC18∶2 LAC18∶3 ALA
      YM2523521.91±.0.7314.21±0.681.52±0.072.33±0.2742.05±1.0714.20±1.011.41±0.42
      YM25235/pRHRkHMGCR26.36±1.13*12.17±0.951.45±0.230.98±0.5338.32±1.74*16.03±0.642.02±0.57
      表中数据为3次独立实验的平均值±标准差. 重组菌株与对照菌株之间进行t 检验,*表示p <0.05.

      表 4  RkHMGCR基因过表达对YM25235菌株脂肪酸组分质量分数的影响

      Table 4.  Effect of RkHMGCR overexpression on the content of fatty acid compositions in YM25235

    • 为进一步探究过表达RkHMGCR基因促进YM25235类胡萝卜素合成的调节机制,我们分析了类胡萝卜素合成和油脂代谢相关基因转录水平变化. 结果如图4所示,过表达RkHMGCR基因能促进MVA途径中基因RkAcat2RkHMGCS、自身RkHMGCR转录水平的明显提高,分别为对照的1.76、1.58和4.14倍,而类胡萝卜素合成途径中基因RkCrtYBRkCrtI的转录水平略有提高,但不显著. 此外,与油脂合成相关基因RkFAS1RkACCS转录水平分别下降了59.31%和40.23%,而与脂肪酸β-氧化相关基因RkACOX2转录水平则也有显著提高,达2.18倍. 这些结果与类胡萝卜素的合成水平和油脂含量的积累趋势一致,只是不同基因转录水平的变化有所差异.

      图  4  RkHMGCR基因过表达对YM25235菌株中类胡萝卜素合成和油脂代谢相关基因转录水平的影响

      Figure 4.  Effect of RkHMGCR overexpression on the transcription levels of genes involved with carotenoid biosynthesis and lipid metabolism

    • HMGCR广泛存在真核生物、原核生物和古细菌中,是一种高度保守的膜结合酶[9]. 氨基酸序列相似性搜索结果显示,红冬孢酵母RkHMGCR与酵母来源的HMGCR具有最大的同源性. 氨基酸序列分析结果也显示,红冬孢酵母RkHMGCR同样具有HMGCR保守的2个底物结合位点ENVVGYMPLP和TTEGALVA、2个NADP(H)结合位点DAMGMNMIS和GTVGGGT,以及4 个催化活性中心关键的氨基酸残基 Glu、Lys、Asp、His,而且序列比对分析结果还显示,所分析的4种HMGCR的C端氨基酸序列同源性虽然高于N端,但是总体同源性均很低,这些均与之前的研究结果一致[13-14]. 这些结果表明,我们获得的RkHMGCR基因是一个新的潜在的HMGCR基因.

      由于HMGCR在MVA途径以及包括类胡萝卜素等异戊二烯衍生物合成中的重要调节作用,可以推测出提高HMGCR的表达水平可显著提高类胡萝卜素等异戊二烯衍生物的合成水平. 这在许多通过代谢工程手段将HMGCR基因过表达提高宿主细胞中类胡萝卜素的合成的研究中获得证实,比如,Yan等[8]通过产β-胡萝卜素的重组酿酒酵母工程菌株中过表达HMGCR基因,β-胡萝卜素产量提高了35.1%,如果同时抑制麦角固醇合成则提高了106.8%. 还有一些研究将截短的外源HMGCR基因在不同重组酵母宿主中过表达,都能显著提高目的类胡萝卜素的产量[26-28]. 本研究将RkHMGCR基因转化回YM25235菌株中进行过表达分析,与上述报道类似,RkHMGCR基因过表达显著提高了YM25235菌株中类胡萝卜素的合成水平,相较于对照提高了42.21%,其合成相关基因的转录水平分析也证明了这一点. 相较于类似的研究[27-28]RkHMGCR基因过表达的YM25235菌株类胡萝卜素产量的增加不是最高,这可能是培养条件和表达系统存在差异的原因,并且细胞内甲羟戊酸供应的瓶颈不仅仅是HMGCR催化的反应,还涉及AcaT 和HMGCS的催化作用[29]. 然而,本研究结果证明了提高MVA途径限速酶HMGCR的表达水平可显著提高类胡萝卜素的产量.

      红法夫酵母类胡萝卜素合成调节机制的研究表明,葡萄糖不足或饥饿条件下菌株中类胡萝卜素合成与氧化胁迫有关,还涉及脂代谢和糖代谢等生物学过程[30-31]. 乙酰CoA是油脂(脂肪酸)和类胡萝卜素合成的共同前体,有研究表明,粘红酵母(Rhodotorula glutinis)在葡萄糖不足或饥饿条件下通过选择性降解棕榈酸和油酸,产生乙酰CoA促进类胡萝卜素的合成,导致油脂累积减少[32-33]. 我们前期的研究也显示,葡萄糖饥饿条件下YM25235菌株中油脂累积水平明显下降(结果未发表),而过表达RkHMGCR基因脂肪酸含量也明显下降(表3表4),导致油脂累积下降更加明显与脂肪酸降解相关基因的转录水平显著增加也证明这一点. 而且,RkHMGCR基因过表达的YM25235菌株中类胡萝卜素合成增加的底物乙酰CoA可能主要来自棕榈酸和硬脂酸的降解,而油酸含量下降可能是由于其进一步脱饱和形成亚油酸和α-亚麻酸所致,多不饱和脂肪增加的具体原因还有待于进一步研究.

      由于类胡萝卜素良好的生物活性和生理功能,近年来被广泛应用在食品、医药、营养保健等行业,促进了人类对其需求. 目前,商业化的类胡萝卜素来源主要通过化学合成获得,少量从植物提取和微生物发酵生产的天然类胡萝卜素,虽然具有类似的分子结构,但天然类胡萝卜素更有利于健康[1]. 通过传统微生物发酵技术生产类胡萝卜素显示出巨大潜力,成本低、生产过程易于处理、产品安全而且环保[34]. 但是,目前由于成本效益、产量和分离提取等方面的限制,工业化规模发酵生产方面仍缺乏相应的策略[35]. 近年来,结合经典遗传学和现代分子生物学方法以及发酵工艺技术,优化菌株原有的代谢途径和调节网络或者组装异源代谢途径使微生物高效益、低成本生产类胡萝卜素的代谢工程提供了一种有希望的替代途径[15]. 因此,本研究为进一步筛选类胡萝卜素高产菌株和工艺化生产类胡萝卜素的研究与应用打下基础,也为利用产油红酵母进行相关的代谢工程研究提供参考. 目前,这方面的研究鲜有报道.

参考文献 (35)

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